Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء يزدرع المحسنة التي ينطوي

Abstract

القشرية التنمية ينطوي على التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية وغير العصبية العناصر بما في ذلك الخلايا السلائف، والأوعية الدموية، والسحايا المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بها. لأنها توفر بيئة مناسبة عضوي النمط، وغالبا ما تستخدم إإكسبلنتس شريحة القشرية للتحقيق في تلك التفاعلات العصبية التي تتحكم التمايز والتنمية. على الرغم من فائدة، لا يمكن للنموذج يزدرع شريحة تعاني من عيوب بما في ذلك التصفيح الخلوية الشاذة والهجرة. نحن هنا نورد ككل يزدرع نصف الكرة المخية نظام لدراسات التنمية في وقت مبكر القشرية التي هي أسهل لإعداد شرائح من القشرية وعروض الهجرة عضوي النمط ثابت والتصفيح. في هذا النظام النموذجي، التصفيح المبكر وأنماط الهجرة بشكل طبيعي لمدة يومين في المختبر، بما في ذلك فترة تقسيم preplate خلالها طبقة قشرية المحتملين ستة أشكال. ونحن بعد ذلك وضعت الصعق الكهربائي الرحم EX (EUEP)النهج الذي يحقق النجاح ~ 80٪ في استهداف التعبير GFP إلى الخلايا العصبية في القشرة النامية الإنسي الظهرية.

ويزدرع نصف الكرة كله يجعل من تطوير نموذج القشرية في وقت مبكر للوصول للتدخل، الصعق الكهربائي الدوائية والنهج التصوير الحية. هذا الأسلوب يتجنب الجراحة المطلوبة من البقاء على قيد الحياة في الرحم الصعق الكهربائي (IUEP) النهج مع تحسين كل من ترنسفكأيشن والمساحي الاتساق الاستهداف. وهذه الطريقة تسهل من الدراسات التجريبية العصبية الهجرة، والانتشار والتمايز.

Introduction

والثدييات أشكال قشرة الدماغ من خلال الهجرة متضافرة، والانتشار والتمايز للخلايا العصبية ولدت على التوالي. ولادة كل الخلايا العصبية في منطقة البطين (VZ) ويهاجر من VZ إلى منطقة وسيطة (IZ)، وتشكيل لوحة القشرية (CP) 1. لأنها تمر من خلال المجالات المختلفة القشرية، الخلايا العصبية المهاجرة عرض وسائط متعددة من الهجرة 2،3 التي تعتمد على البيئة خارج الخلية والعناصر الخلوية الأخرى (مثل الخلايا الدبقية شعاعي) داخل الأنسجة النامية. الخلايا العصبية القشرية اعتقال ثم الترحيل في الجزء العلوي من لوحة لتشكيل القشرية في عمليات الاعتقال تتزامن الهجرة العصبية و 4 dendritogenesis.

يبدأ التنمية القشرية بين 11-13 يوما الجنينية (E11-13) من 5 إلى إنشاء طبقة ضفيري البدائية 6 أو preplate (PP)، طبقة من الخلايا العصبية التي يعتلي رائدة في VZ. محتملطبقة 6 الخلايا العصبية القشرية (أي الخلايا العصبية القشرية 1 لدت في VZ) ثم توجيه بهم somata في نمط النمطية ويندمج في طبقة متميزة في PP 7. تقسيم هذه الأحداث إلى preplate (طبقة المستقبل القشرية 1) هامشية سطحية وعميقة منطقة، وهذا الأخير يتألف من خلايا subplate (طبقة قشرية عابرة 7). هذه العملية، تسمى تقسيم preplate، هو حدث تأسيسي في النمو المستقبلي للقشرة الدماغ 8.

وقد تم تحديد العديد من الطفرات الوراثية التي تعطل مختلف جوانب التنمية القشرية 9. ويمكن أيضا أن تتأثر التنمية القشرية سلبا التعرض للسموم بلعها مثل الكوكايين 10 و الكحول 11. لأن التشوهات القشرية التي تنشأ خلال التنمية هي من المساهمين المحتمل أن الاضطرابات العصبية (مثل التوحد وانفصام الشخصية)، والتحقيقات التجريبية للاضطرابات في التنمية القشرية متأصلةالمهم لي. ولذلك من الأهمية بمكان وضع نهج لدراسة التنمية القشرية التي تسمح المقايسات السريع للآثار السمية الوراثية أو التي تحفظ ولكن أيضا التفاعلات الممكنة بين الخلايا العصبية التمييز، وغيرها من أنواع الخلايا المصفوفة خارج الخلية (ECM) خلال هذه الفترة المبكرة من نمو الدماغ 12 .

وقد وفرت إإكسبلنتس شريحة 13 مثل هذا النظام واستخدمت على نطاق واسع في التنمية فحص الخلايا العصبية القشرية 14-16. ومع ذلك، يمكن المقايسات شريحة تعاني من عيب أن الهجرة العصبية ويمكن أن يكون غير طبيعي التصفيح 17 ربما بسبب الضرر الذي يلحق الخلايا السحائي التي تحيط الدماغ النامية ومرساة وشعاعي الدبقية سقالة. كما قد الدبقية الألياف الشعاعية هي الركيزة الهامة لتعطيل الخلايا العصبية القشرية 18 الهجرة من الصفيحة القاعدية عن طريق تشريح تعطيل محليا العمارة الدبقية شعاعي وتؤدي إلى الهجرة القشرية تغييرها. وبالإضافة إلى ذلك سليدائرة الهندسة المدنية من السطوح إإكسبلنتس يوفر المنطقة من الخلايا الميتة التي قد تغير من تركيبة طبيعية من ECM في هذه المجالات.

وقد ركزت المناهج الأكثر حداثة تحليلهم على خلايا تقع في عمق شريحة التي تحيط بها أنواع الخلايا المناسبة صحية وECM. ومع ذلك، في بعض الحالات يمكن لهذه المناهج الجديدة تتطلب أن شريحة المثقفين الأصلي سميكة يكون البرد مقطوع مقطوع أو البارافين، بعد التثبيت بحيث يتم الداخلية عادية نسبيا من شريحة المتاحة للتحليل 19-21. كل من vibratome الأصلي تقطيع لإعداد شرائح حية للثقافة وكذلك cryosectioning اللاحقة من شرائح محددة للتحليل تتطلب الرعاية والجهد لهذه المقايسات للعمل.

لتوفير بسيطة، نهج تكميلية لدراسات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقمنا بتعديل النهج القائمة شريحة 13 إلى تسهيل الدراسات القشرية للتنمية في وقت مبكر. وقد وضعنا WHأوله نموذج يزدرع نصف الكرة مماثلة لنموذج موجود E14 نصف الكرة بأكملها التي تشارك الثقافات تهز في 65 دورات في الدقيقة والنمو عضوي النمط يسمح ل16-18 ساعة 22،23. في نهجنا، يتم وضع إإكسبلنتس نصف الكرة كله على غشاء شبه منفذ 13 مع الأكسجين في جو الثقافة العالية 21،24 تمديد نمو عضوي النمط القشرية لمدة 48 ساعة. هذا النهج يسمح أيضا الصعق الكهربائي ثابت من الخلايا العصبية النامية القشرية. تتم إزالة الأجنة من الرحم وelectroporated DNA البلازميد لإدخال ويتم تشريح الدماغ الانتهائي ثم. يتم عزل كل نصف الكرة ووضعها أسفل على الجانب الإنسي مرشح الكولاجين المغلفة. ويستزرع ثم ​​يزدرع لمدة 48 ساعة، وهي الفترة التي تشمل تقسيم preplate 8. خلال الفترة الثقافة، L6 الخلايا العصبية من تطوير الخلايا العصبية مقدمة لتمييز 25، صحيح داخل لوحة القشرية. طوال هذه الفترة الناميةوتحيط الخلايا العصبية من قبل ECM المناسبة والتي من شأنها أن أنواع الخلايا مواجهة الخلية المقابلة في الجسم الحي. وقد أثبت هذا النظام بالفعل قيمة في فك رموز أحداث الخلوية التي تكمن وراء سمية الإيثانول 26، وتشكيل طبقة 6 preplate تقسيم 7،25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporations الرحم السابق مع الأخضر التعبير بروتين فلوري البلازميد

  1. يتم إعداد البلازميد الحمض النووي مع حلول حقن CAG-DNA 27 EGFP المخفف لتركيز العمل النهائية قدره 0.33 ملغ / مل في DDH 2 O. وتستخدم QIAGEN إندو خالية من ماكسي إستعداد لتنقية البلازميد من البكتيريا المتحولة. يضاف صبغ الأخضر بسرعة 0.02٪ في ~ (W / V النهائي) في حل DNA باعتباره التتبع الحقن.
  2. لإعداد منطقة العمليات الجراحية، رش أعلى إلى أسفل مقاعد البدلاء وتشريح مرحلة المجهر مع حل الإيثانول 70٪ وجففي. رش مقص وملقط جراحي مع الايثانول 70٪ قبل تشريح وجففي.
  3. وضحى توقيت الحوامل السويسري / ويبستر السدود على E13 عن طريق التحويل إلى غرفة مليئة CO 2 من اسطوانة مضغوطة ويتم رصد السد حتى عن توقف الحركة لمدة لا تقل 1 دقيقة. بعد التضحية عن طريق الاستنشاق 2 CO تتم إزالة الأجنة من الرحم ووضعها فيمن 10 سم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة محلول ملحي متوازن هانكس (HBSS).
  4. تشريح الجنين بعناية كل من الأغشية المحيطة من خارج الجنين والحفاظ على الجليد الباردة في HBSS.
  5. نقل كل جنين على حدة لثانية 10 سم طبق بتري تحتوي على HBSS الباردة. استخدام حقنة لحقن هاميلتون 2-3 ميكرولتر من خليط DNA الخضراء بسرعة إلى البطين من نصف الكرة المخية الأيسر، مع الحرص على حقن في منطقة منفصلة مكانيا القشرية من المنطقة القشرية للتحليل في المستقبل.
  6. لelectroporate، اضغط بلطف الجنين بالملقط ووضع برفق مجداف إيجابية من القطب منتاش على خط الوسط الظهرية من الرأس ووضع برفق مجداف السلبية تحت الذقن الجنين. يتم تحقيق Electroporations مع electroporator BTX830 مبرمجة لتقديم 5 30 نبضة V لمدة ميللي ثانية 50، مفصولة فترات ميللي ثانية 950. هذه الإعدادات لنموذج BTX830. ويمكن استخدام أنظمة أخرى وفقا لinstructio الشركة المصنعةNS.

2. كامل نصف الكرة إعداد يزدرع

  1. بعد الصعق الكهربائي و توضع الأجنة مرة أخرى إلى الجليد الباردة HBSS. تتم إزالة الدماغ باستخدام ملقط صائغ 2 # 5 لإزالة الجلد والجمجمة الغضروفية من الرأس الجنين. وبعد ذلك تراجع forcep تحت المخ لإزالة المخ من الجمجمة سليمة. ثم يتم تشريح نصف الكرة electroporated (يسار) بعيدا عن الدماغ وتتم إزالة المرفقة منتصف الدماغ الأنسجة. في جميع أنحاء تشريح الرعاية الإجراء المتخذة للا ضرر السحايا المغطي نصف الكرة المخية الأيسر القشرية.
  2. تشريح مرة يتم نقل كل جنين في HBSS باستخدام pipettor مع خفض تلميح ماصة 1 مل. وطرد نصف الكرة برفق على إدراج ثقافة الكولاجين المغلفة. يتم ترتيب ما يصل إلى نصف الكرة إإكسبلنتس 6 الجانب الإنسي لأسفل على كل إدراج 24 ملم. تتم إزالة ترتيب مرة واحدة، HBSS الزائدة من إدراج ويتم وضعها بعد ذلك في واحدة إدراج 35 مم جيدا طبق 6 أيضا. يحتوي البئر إكساءctly 2،7 مل من وسائل الإعلام: وسائل الإعلام F12-DMEM تحتوي على Glutamax وتستكمل مع 2٪ B-27، 1٪ و 1٪ G5-البنسلين بكتيريا. يمكن pipetted بضع قطرات من وسائل الإعلام من البئر على رأس كل يزدرع، ولكن لا تقم بإضافة وسائل الإعلام الزائد عن 2،7 مل لكل بئر الأصلي.
  3. مرة واحدة وقد تم وضع إإكسبلنتس على مرشحات الكولاجين يتم وضع صحن يحتوي على 6 جيدا إإكسبلنتس في غرفة بيلوبس (BR) روتنبرج (يحتوي أيضا على طبق الرطوبة من الماء). هي التي غرست A 95٪ / 5٪ أكسجين / CO خليط الغاز 2 في غرفة لمدة لا تقل 1 دقيقة قبل اغلاق اغلاق الدائرة وفصل 95٪ / 5٪ أكسجين / CO إمدادات الغاز 2 أنبوب. ثم يتم وضع الدائرة BR إلى 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة حاضنة للفترة المتبقية من الفترة الثقافة، 1-2 DIV.

3. تثبيت من الأنسجة يزدرع لعلم الأنسجة

  1. في غطاء الدخان إعداد الحل تثبيت باجانو من جانب أول مجموعة ال 8 solubilizing من بارافورمالدهيد في 100 مل من مسخن (دي & ~ 80ز؛ C) DDH 2 O. إضافة قطرات 1-3 تتركز هيدروكسيد الصوديوم لتعزيز الانحلالية ويحرك المزيج بلطف. solubilized مرة واحدة مزيج الحل بارافورمالدهيد 8٪ 1:1 مع الحل الذي هو 500 ملم السكروز، HEPES 100 ملم، درجة الحموضة 7.4، 50 ملم MgCl 2 و 5 مم للبوكل تركيز النهائي من بارافورمالدهيد 4٪ في 250 ملي HEPES السكروز 50 مم ، 25 ملم MgCl 2، 2.5 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. لإصلاح إإكسبلنتس الحارة الحل الإصلاح باجانو إلى 37 ° C. إزالة بسرعة معظم وسائل الإعلام من كل ثقافة DMEM/F12 جيدا وإضافة 5 مل من إصلاح باجانو إلى كل بئر من إإكسبلنتس. تأكد من تغطية كل يزدرع تماما في الإصلاح. إصلاح 1 ساعة في RT. لا تقم بإزالة إإكسبلنتس من مرشح قبل 1 ساعة من التثبيت.
  3. بعد تثبيت الإصلاح إزالة الحل باجانو واستبدال الحل باجانو دون الإصلاح (250 ملي ملي HEPES السكروز 50، 25 ملم MgCl 2، 2.5 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة بضع قطرات من أزيد الصوديوم 10٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تضمين.

4. التضمين وSectioning لعلم الأنسجة

  1. إعداد الجلد العجل حل الجيلاتين 10٪ من solubilizing 10 غرام من العجل الجلد الجيلاتين في 100 مل من الماء الدافئ (55-60 ° C). وضع حل الجيلاتين على طبق ساخن لتعيين 60 ° C وعباب دوري حتى solubilized.
  2. صب حوالي 10 مل من محلول الجيلاتين 10٪ في الجزء السفلي من طبق بتري الطول 10 و 30 دقيقة تسمح لترسيخ. وهذه الصورة "لوحة" لتضمين إإكسبلنتس. يمكن لهذه أن تكون منصات معدة مسبقا أيام وتخزينها في C. ° 4 استخدام مسطرة لرسم الشبكة على الجزء السفلي من طبق بتري ونقل إإكسبلنتس الفردية في كل مربع من الشبكة. إزالة المتبقية باجانو الحل واستخدام pipettor، مع تغطية كل يزدرع حل الجيلاتين الدافئ 10٪ والسماح لترسيخ. بالإضافة إلى ذلك بطء استئناف حل الجيلاتين حتى يتم محاطة بالكامل من قبل كل يزدرع الجيلاتين، مع الحرص على عدم ذوبان لوحة بإضافة الكثير جدا الحارة الجيلاتين في آن واحد. السماح لتتصلب الجيلاتين لللساعة 1 ~. وبمجرد أن تصلب individويمكن خفض إإكسبلنتس يو ايه ال في كتل صغيرة من الجيلاتين. ثم يتم إضافة لبنات ثابتة في باجانو إصلاح ساعة لمدة 24-48 قبل تقطيع مع vibratome.
  3. يتم وضع إإكسبلنتس الجيلاتين في كتل البصلة الشمية ويصل مقطوع في الطائرة الاكليلية في سمك ميكرومتر 100. يتم جمع المقاطع وتخزينها في PBS + أزيد الصوديوم 0.1٪ في 4 درجات مئوية حتى تجهيز المناعى.
  4. يتم تنفيذ الكشف المناعى عن طريق تحويل الأقسام إلى لوحة بئر 24 (2-3 أقسام لكل بئر). أول كتلة غير محددة الأجسام المضادة ملزمة بإضافة 0.5 مل + B PBST (PBS + 0.5٪ تريتون X 100 و 2٪ BSA) إلى كل بئر، 1 ساعة احتضان مع اهتزاز لطيف. ثم يتم تخفيف الأجسام المضادة المناسبة الابتدائية في PBST + B وبنسبة 0.4 مل لكل بئر لالحضانة بين عشية وضحاها في RT. يغتسل بها مع 3X الأولية PBS يغسل ما لا يقل عن 10 دقيقة لكل منهما. الجسم المضاد الثانوي و 2 ميكروغرام / مل هويشت 33342 مخففة ثم وصمة عار في PBST النووية + B ويتم تحضين العينات لمدة 2 ساعة في RTمع اهتزاز لطيف. يتم تنفيذ ثلاثة يغسل PBS (10 دقيقة لكل منهما) ومن ثم يتم تحميل المقاطع على الشرائح باستخدام 90٪ 50 ملي تريس الجلسرين، pH7.4، ووسائل الإعلام في تصاعد مستمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

والجنينية القشرة القوارض يسلك الانحدار العصبية الوراثية عرضية خلال الفترة الإنمائية، مثل القشرة المخية الحديثة أن ما يقرب من 1 الوحشي اليوم أكثر نضجا من القشرة المخية الحديثة الإنسي الظهرية 28. وبالتالي يتم إنشاء الجزء الأكبر من طبقة 6 الخلايا العصبية (أي يحمل النهائية من المرحلة S-) على E12 في القشرة الجانبية (وتسمى أيضا الميدانية 40 5) وفي E13 في القشرة الظهرية وسطي (وتسمى أيضا حقل 1 5). تقسيم Preplate يبدأ اليوم حوالي 1 طبقة الخلايا العصبية بعد جيل 6 و بالتالي يبدأ في القشرة الجانبية على E13 والقشرة الظهرية على E14. لدراسة تقسيم preplate والشروع في تطوير لوحة القشرية أو تعديلها لدينا فحص شريحة يزدرع 21،24 مثل التي تم تربيتها نصفي الكرة المخية كامل عادة من E13 E15 ل(الشكل 1).

نحن اختبار جدوى هذه التقنية يزدرع القشرية من خلال دراسة نمو إإكسبلنتس نصف الكرة كله دerived من الفئران تيراغرام GSAT (Eomes :: EGFP) (الشكل 2). هذه السلالة الماوس يحتوي على التحوير التي تقارير الخلايا العصبية غير ناضجة من النسب والقشرية مثير 7،29،30. وأعدت إإكسبلنتس نصف الكرة كله القشرية في E13، عند نقطة الوقت قبل preplate تقسيم القشرة المخية الحديثة في ظهري (الشكل 2A). كانت إإكسبلنتس القشرية من القمامة نفس قطرة ثابتة بالتتابع على مدى فترة من 2 DIV ومعالجتها للتحليل النسيجي لاحقة. عند نقطة تحليل الوقت الأولي (DIV 0)، تقسيم preplate لم يحدث حتى الآن في مجال 1 (القشرة المخية الحديثة الظهرية وفاعليات 2A، 2E). وبحلول 1 DIV CP هو واضح (أرقام 2B، 2C، 2F، 2G)، وأنها لا تزال تنمو لتصل إلى 2 DIV (أرقام 2D، 2H). وبالتالي إإكسبلنتس نصف الكرة كله مثقف في البداية في دعم E13 لمدة يومين نضوج قشرة الدماغ ويلتقط تقسيم preplate في القشرة المخية الحديثة الظهرية.

لتأكيد القاعدةشركة التنمية النسيجية في القشرة المخية الحديثة الظهرية، ونحن immunostained إإكسبلنتس DIV 2 للبروتيوغليكان كبريتات شوندروتن (CSPGs)، عنصرا المصفوفة خارج الخلية التي هي أيضا علامة المعمول بها في PP ومشتقاته وMZ SP 8،31،32. المناعية للCSPGs يكشف شريطين من CSPG تفاعلية مناعية في القشرة الظهرية تشير إلى تقسيم المناسبة من PP إلى MZ وSP خلال الفترة الثقافة في المختبر (أرقام 3A-3C). يتم تقسيم PP من الخلايا العصبية القشرية L6 التي هي معروفة للتعبير عن عوامل النسخ Ctip2 و7،33،34 Tbr1. نمط المناعية من هذه العلامات (الأرقام 3D-3F، 3G-I، على التوالي) يؤكد التعبير الملائم لهذه عوامل النسخ في CP التي شكلت حديثا. معا هذه التحليلات تؤكد عضوي النمط التنمية القشرية في وقت مبكر من إإكسبلنتس نصف الكرة بأكمله.

في الرحم وقد استخدمت على نطاق واسع electroporationsلفحص لوظيفة الخلية الجينات المستقلة في القشرة النامية 35. تم اختبار ما إذا كان ذلك يمكن أن الصعق الكهربائي بالنقل بنجاح الخلايا العصبية في نصف الكرة نموذج يزدرع كله. تم حقن البطين الأيسر للأجنة سليمة E13 مع 0،33 ملغ / مل CAG-GFP البلازميد وelectroporated (انظر طرق) لإدخال DNA البلازميد في السلائف الخلايا العصبية التي تبطن البطين الجانبي (الشكل 1A). بعد 2 DIV أسقطت إإكسبلنتس الثابتة ومقطوع للتحليل النسيجي. عند هذه النقطة الوقت، شوهدت الخلايا GFP التعبير في جميع المناطق القشرية الدماغية عبر الجدار (أرقام 4A-4C). ويمكن ملاحظة GFP التعبير من السلائف الخلايا العصبية في حين لوحظت VZ الخلايا GFP مكثفة في التعبير عن IZ وCP. الأهم من ذلك، لوحظت العديد من الخلايا العصبية في GFP + الجزء العلوي من تشكيل CP مع التشعبات الناشئة ومحاور عصبية. وقد شكلت خلايا طبقة منفصلة في واجهة بين CP وindicatin MZز اعتقال الهجرة المناسبة والتصفيح (أرقام 4A-4C، السهام). والتشعبات في توسيع محاور عصبية MZ بينما القشرة تمتد تحت CP وإلى IZ (أرقام 4A-4C و 5، انظر أيضا S1 الفيلم إضافي). أدناه هي الخلايا GFP + التفريق الخلايا في دول مختلفة من النضج، بما في ذلك الخلايا العصبية مع التشكل الثنائي القطب، جنبا إلى جنب للألياف الدبقية شعاعي وتحتها، الخلايا العصبية متعدد الأقطاب في IZ (أرقام 4D-4F). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أن التشعبات التي تمتد إلى MZ حيث ريلين reelin البروتين ECM هو مناسب immunolocalized (أرقام 4G-4I). الشروط الصعق الكهربائي وبالتالي تسمح يزدرع التطور الطبيعي للخلايا العصبية القشرية خلال مراحل تمهيدا لترحيل الخلايا العصبية غير ناضجة الخلايا العصبية لتمييز.

في وقت الصعق الكهربائي و (E13) 100٪ من الخلايا العصبية التي تنتجها VZ في القشرة المخية الحديثة الظهرية هي الخلايا العصبية L6، الخلايا العصبيةأن تقسيم PP 5. الصعق الكهربائي الناجح يتطلب أن يبني قدم في الخلايا العصبية خلال ساعة 6 مباشرة قبل، أو أثناء، 36 M-مرحلة من مراحل دورة الخلية. ومن المتوقع بالتالي أن أقرب تالية للتفتل، GFP + الخلايا العصبية بعد الصعق الكهربائي و E13 في القشرة الظهرية (حقل 1) يجب ملء CP تشكيل. وقد لوحظت هذه الخلايا العصبية (الشكل 4) مما يدل على أن البروتوكول يمكن أن تستهدف الخلايا العصبية القشرية L6 موثوق للدراسات الهجرة والنضج.

لتقدير "معدل نجاح" الإجراء الصعق الكهربائي و / يزدرع قمنا بتحليل تحقيق جار من مختبرنا. في سياق هذه الدراسة، تم إعداد 21 ليترات من إإكسبلنتس، وelectroporated ما مجموعه 248 الأجنة (كما هو موضح أعلاه) مع GFP-CAG، وأعد واحدة من نصف الكرة يزدرع كل الجنين. من إإكسبلنتس 248 الأصلي، تم الحكم على 195 (79٪) مناسبة للتصوير والتحليل. ما يقرب من نصف ال 53إإكسبلنتس التي لا يمكن تحليلها فشل في التعبير عن GFP أو كان سوء التعبير GFP المستهدفة. وأوضح الخسائر المتبقية من النمو تشوه بسبب يزدرع مفرزة من تصفية الثقافة، أو معالجة المشاكل المرتبطة النسيجية. وقد أدى هذا معدل نجاح ما يقرب من 80٪ (الشكل 5) نظام يزدرع مناسبة للدراسات الدوائية 26، فضلا عن تحليل الطفرات المتنحية 7 التي تؤثر سلبا على التنمية القشرية في وقت مبكر.

الشكل 1
الشكل 1. يتم حقن كامل الإجراء يزدرع نصف الكرة مع الصعق الكهربائي الرحم السابقين. A) أجنة الفئران E13 مع حل DNA البلازميد وelectroporated. وتشريح أدمغة ومقطوع sagitally. وelectroporatedثم توضع نصف الكرة الجانب الإنسي لأسفل على الكولاجين المغلفة تصفية ومثقف ل2 DIV. ويمكن بعد ذلك نصفي الكرة الأرضية يمكن تصوير الحية أو الأنسجة المحدد لاحقة وتحليل التصوير. B) صورة من 10 إإكسبلنتس وضعت على ثلاث مرشحات في ستة جيدا الأنسجة طبق الثقافة. C) يتم وضع طبق على ستة إإكسبلنتس مع الأكسجين في بيئة عالية (95٪ O 2/5٪ CO 2) في غرفة حاضنة بيلوبس-روتنبرج، التي وضعت بعد ذلك في مستوى 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة الثقافة.

الشكل 2
الشكل 2. نمو عضوي النمط من لوحة القشرية في نصف الكرة إإكسبلنتس كله مستمدة من القمامة واحدة من Eomes :: الأجنة EGFP. A، E) وهناك قسم من الدماغ الاكليلية انخفاض ثابت في بداية عبادة فترة لدى عودتهم (O DIV). لاحظ أن PP موجود ولكن أن CP لم تشكل. ويتم إنتاج الإشارة الخضراء من خلال التعبير GFP في الخلايا العصبية غير ناضجة مثير والأزرق هو الصبغة التي تصف هويشت نواة كل الخلايا. B، F). ويلاحظ نمو CP، الرمز بواسطة الخطوط المتقطعة، بنسبة 0.5 DIV وزيادة بنسبة 1 DIV (C و G) و 2 DIV (D ألواح وH). لاحظ زيادة سمك من GFP التعبير عن نطاق خلية في AD وحات، مما يدل على انتشار وتمايز الخلايا العصبية من نسب مثير في يزدرع. على نطاق والحانات على بعد 500 ميكرومتر (A وحة) و 50 ميكرون (لوحة H). الاختصارات: CP، لوحة القشرية؛ IZ، منطقة وسطى؛ MZ، المنطقة الهامشية؛ SP، Subplate؛ VZ، منطقة البطين.

/ 50271/50271fig3.jpg "/>
الشكل 3. تقسيم Preplate في نصف الكرة إإكسبلنتس كله. AC) شوندرويتين كبريتات بروتيوغليكان (CSPG) المناعية يوضح تقسيم (تجزئة) من PP إلى MZ وDF SP.) التعبير عن النسخ Ctip2 عامل في CP التي شكلت حديثا. GI) التعبير عن النسخ Tbr1 عامل في CP التي شكلت حديثا. على نطاق والحانات هي 50 ميكرومتر في لوحات C، F، I.

الشكل 4
الشكل 4. GFP التعبير في نصف الكرة إإكسبلنتس كله بعد الصعق الكهربائي و E13 الرحم السابقين. AC) GFP التعبير بعد 2 DIV. ملاحظة طبقة من الخلايا العصبية القشرية في تشكيل الجزء العلوي من CP (الأسهم). DF) Nestin (أحمر) immunoreactivإيتي في قسم من يزدرع نصف الكرة بأكمله. GH) ريلين reelin (أحمر) تفاعلية مناعية في قسم مستمدة من يزدرع نصف الكرة بأكمله. على نطاق والحانات في لوحات C، F، I وهي 50 ميكرومتر.

الشكل 5
الشكل 5. وelectroporated تقلب في استهداف electroporations الرحم السابقين إلى القشرة وسطي الظهرية (حقل 1). أحد عشر الأجنة من القمامة واحد مع بناء التعبير GFP-CAG (0.33 ملغ / مل) ومثقف وإإكسبلنتس نصف الكرة بأكمله. AI) أظهرت تسعة من أحد عشر إإكسبلنتس التعبير عن GFP في القشرة الإنسي الظهرية. على الرغم من GFP التعبير يختلف بين إإكسبلنتس، في كل GFP يزدرع تم الكشف في جميع المناطق الثلاث القشرية (أي VZ، IZ وCP). شريط النطاق هو 50 ميكرومتر في الفريق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد قمنا بتحسين وتقييم نموذج تجريبي - إإكسبلنتس نصف الكرة كله - لدراسة التنمية القشرية في وقت مبكر (E13 E15-). أثبت نموذجا مفيدا لتحليل الهجرة وتمايز الخلايا العصبية من نسب مثير تشكل طبقة 6 من قشرة الدماغ 25،37. مزايا مبدأ النظام هي 1) النمو عضوي النمط لمدة 2 DIV، 2) إعداد بساطة، و3) الوصول إلى الخلايا العصبية التجريبية للتلاعب، الصعق الكهربائي الدوائية والتصوير خلال هذه الفترة، الأولى الحرجة من نمو المخ. لقد استخدمنا نظام لتوثيق الفروق الدقيقة في التشكل، والتوجه، والنمو من الخلايا العصبية الجذعية 6 طبقة قشرية 7،38 خلال الفترة من تقسيم preplate.

وتتكون إلى حد كبير الخلايا العصبية التي تعيش مثير طبقة الخلايا العصبية 6 من الإسقاط القشري التي توفر المدخلات متبادلة لالمهاد الظهري 39،40 41. على الرغم من أن هذه الخلايا العصبية هي من الناحية الفسيولوجية المتخصصة، وعملية توليد والهجرة ونضوج الخلايا العصبية طبقة 6 أسهم السمات الأساسية مع جميع الخلايا العصبية في طبقات مثير 2-6 من القشرة. على وجه التحديد، يتم إنشاء جميع الخلايا العصبية القشرية مثير في الدماغ الانتهائي للVZ الظهرية، من خلال ترحيل IZ باسم الخلايا العصبية متعدد الأقطاب، وتفرق داخل ال 7 CP. هو الدافع وراء نضوج الخلايا العصبية القشرية مثير من مجموعة أساسية من عوامل النسخ أعرب بالتسلسل: Pax6، Tbr2، و 29 Tbr1. ويشارك هذا التسلسل من قبل جميع الخلايا العصبية في طبقات مثير 2-6 42 و أكدنا على التعبير الملائم للTbr1 في CP التي شكلت حديثا (3G-3I أرقام). ينبغي استخدام هذا النهج لتحقيق تنمية الخلايا العصبية القشرية 6 طبقة بالتالي توفير رؤى أساسية في تطوير NEUrons التي تشكل جميع الطبقات القشرية.

إإكسبلنتس نصف الكرة كله تكمل النهج القائمة لدراسات التنمية الخلايا العصبية القشرية. استخدمت الدراسات السابقة لE14 يزدرع نصف الكرة كله لدراسة نهج التنمية القشرية لمدة 1 DIV 22،23. وإلى جانب أننا إإكسبلنتس نصف الكرة كله مع الصعق الكهربائي الرحم السابقين للتحقيق في 2 يوما من التنمية القشرية خلال الفترة من L6 تشكيل وتقسيم preplate. وعلى النقيض من electroporations في الرحم في E13، ونسبة نجاح electroporations الرحم السابقين تليها يزدرع نصف الكرة كله هو أعلى: في أيدينا نحقق النجاح ~ 80٪ في استهداف الصعق الكهربائي إلى الدماغ الانتهائي الظهرية. بالإضافة إلى ذلك، في electroporations الرحم تتطلب جراحة البقاء وتأخذ جهدا كبيرا أكثر تقنية من النهج نصف الكرة كله الرحم السابقين. وأخيرا، في الدراسات الرحم ليست قابلة بسهولة للدقيقة الدوائيةالتلاعب والنهج التصوير. يتم توفير تحكم دقيق الزمنية في تقديم أو تفعيل المخدرات وكلاء الجزيئية (ناقلات التعبير، يبني إسكات، الخ) بتركيزات محددة مع إإكسبلنتس نصف الكرة كله، ولكن هو أكثر صعوبة لتحقيق في الرحم. يعيش الرصد البصري للآثار الناتجة من مثل هذه التلاعبات، مع القرار المكانية في نطاق ميكرون، في متناول الجميع مع EUEP، ولكن لا IUEP. مثل هذه الدقة ومن المرجح أن تعزز بشكل كبير قوة تفسيرية للبيانات التي تم جمعها من التجارب التي تنطوي على التنمية القشرية وظيفة. وبالتالي من المبكر للدراسات التنمية إإكسبلنتس نصف الكرة كله القشرية تمتلك مزايا تجريبية واضحة على النهج الرحم في. في هذا الوقت، ولكن لدراسات الخلايا العصبية القشرية الطبقة العليا والتجارب التي تتطلب جمع البيانات> 48 ساعة، وشريحة إإكسبلنتس في النهج الرحم يبقى الأفضل.

يوجد متطلبات حرجة عديدة لنجاح هذه التقنية يزدرع نصف الكرة بأكمله. الأول، نمو يزدرع حساس جدا لسلامة الميكانيكية للسحايا. سوف أضرارا مادية السحايا (أي ثقوب أو دموع) كحد أدنى تعطيل التنمية المحلية من القشرة الأساسية. ثانيا، النمو يزدرع حساسة إلى الحجم الكلي للسائل الإعلام في إطار الثقافة أيضا: مع وسائل الاعلام الكثير من إإكسبلنتس سوف فك الارتباط من تصفية وتطوير بنية مشوهة CP؛ مع وسائل الإعلام والقليل جدا من إإكسبلنتس من المرجح أن يذوى وتجربة موت الخلايا المفرط . وأخيرا، مع تقنية إإكسبلنتس الحالي فقد سجلنا نموا القشرية لمدة 2 DIV. عند بدء E13 في هذا الإطار الوقت التنموية، على الرغم من اعترافه التحقيقات قيمة كثيرة، يقيد التحليلات لفترة قبل synaptogenesis والاتصالات العصبية الكنسي. على الرغم من أن الخلايا العصبية القشرية في mRNAs وصريحة E14.5 العديد من البروتينات ترميز متشابك (w.genepaint.org "الهدف =" _blank "> www.genepaint.org)، synaptogenesis لا يبدأ حتى ~ E15 في القشرة الجانبية، ويقتصر هذا synaptogenesis لpreplate الخلايا بدلا من الخلايا العصبية طبقة 6 43. بعض الأسئلة الحرجة المتعلقة القشرية تشكيل المشبك وبالتالي فهي ليست وظيفة عنونة حاليا مع نظام نصف الكرة يزدرع كله.

وفي الختام فإنه يمكن استخدام نصف الكرة يزدرع كله إعداد موثوق وثابت للتحقيق تنمية القشرية في وقت مبكر من نماذج الماوس من التشوهات الموروثة الدماغ. هذه التقنية هي قابلية للتكيف مع رني، shRNA، وغيرها من التلاعب الجزيئية والدوائية. ويزدرع نصف الكرة كله هو أيضا مناسبة لدراسة شملت البروتين المؤتلف تطبيق والمخدرات والسموم البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح NINDS (NS066071) وNIAAA و. (P50AA017823) لECO. الكتاب أشكر الدكتور روبرت كوين والموظفين في وزارة الثروة الحيوانية مختبر لرعاية الحيوانات. نشكر جودسون بلمونت حصول على الدعم الفني، نيكول Belletier للمساعدة على أنه باحث الصيفية الجامعية (SURF). نشكر أيضا الدكتور ديفيد كاميرون للتعليق عليها وتعديلات على إصدار سابق من المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).

Tags

علم الأعصاب، العدد 74، علم الوراثة، علم الأعصاب، علم الأحياء التنموي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الجزيئية، علم الأحياء الخلوي، الهندسة الحيوية، والهندسة الأنسجة، وتقسيم preplate،
<em>بحكم الرحم</em> الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nichols, A. J., O'Dell, R. S.,… More

Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter