Ex utero Electroporation og Whole halvkule explants: A Simple Experimental Method for studier av tidlig kortikal utvikling

Summary

Denne protokollen beskriver en forbedret eksplantering prosedyre som innebærer<em> Ex utero</em> Electroporation, disseksjon og kultur hele cerebral halvkuler fra embryonale mus. Utarbeidelse forenkler farmakologiske studier og analyser av gen-funksjon under tidlig kortikal utvikling.

Abstract

Kortikal utvikling involverer komplekse interaksjoner mellom nevroner og ikke-nevronale elementer inkludert forløper celler, blodårer, hjernehinnene og tilhørende ekstracellulære matrix. Fordi de gir et egnet organotypic miljø, er kortikale slice explants ofte brukt til å undersøke disse interaksjoner som styrer neuronal differensiering og utvikling. Selv gunstig, kan stykket eksplantering modellen lider ulemper inkludert avvikende mobilnettet laminering og migrasjon. Her rapporterer vi en hel cerebral halvkule eksplantering system for studier av tidlig kortikal utvikling som er enklere å tilberede enn kortikale skiver og viser konsekvent organotypic migrasjon og laminering. I denne modellen system, tidlig laminering og migrasjonsmønstrene fortsette som normalt i en periode på to dager in vitro, inkludert perioden preplate splitting, der prospektiv kortikale lag seks former. Vi utviklet en ex utero electroporation (EUEP)tilnærming som oppnår ~ 80% suksess i målretting GFP uttrykket til nevroner utvikling i rygg medial cortex.

Hele halvkule eksplantering modellen gjør tidlig kortikal utvikling tilgjengelig for electroporation, farmakologisk intervensjon og sanntidsavbildning tilnærminger. Denne metoden unngår overlevelse kirurgi kreves av i utero electroporation (IUEP) tilnærminger samtidig forbedre både transfeksjon og areal målretting konsistens. Denne metoden vil lette eksperimentelle studier av neuronal proliferasjon, migrasjon og differensiering.

Introduction

De pattedyr hjernebarken former gjennom felles proliferasjon, migrasjon og differensiering av suksessivt generert nevroner. Hvert nevron er født i ventrikulær sone (VZ) og vandrer fra den VZ i overgangssone (IZ), danner kortikale plate (CP) ^1. Når de passerer gjennom ulike kortikale domener, de trekkende nevroner vise flere moduser av migrasjon ^2,3 som er avhengige av det ekstracellulære miljøet og andre cellulære elementer (f.eks radial gliaceller) innen utvikling vev. Kortikale nevroner deretter arrestere migrasjon øverst formingspartiet kortikale plate i sammenfallende prosesser av neuronal migrasjon arrest og dendritogenesis ^4.

Kortikal utvikling initieres mellom embryonale dager 11-13 (E11-13) ⁵ gjennom etablering av den opprinnelige plexiform lag ⁶ eller preplate (PP), et lag av pioneer nevroner som ligger over VZ. Prospektivlag 6 kortikale nevroner (dvs. de første kortikale nevroner født i VZ) og deretter orientere sin somata i et stereotypt mønster og vokser sammen til en distinkt lag i PP ^7. Disse hendelsene delt preplate inn en overfladisk marginal (fremtidig kortikale lag 1) og en dyp sone, sistnevnte består av subplate celler (forbigående kortikale lag 7). Denne prosessen, kalt preplate splitting, er en grunnleggende hendelse i den fremtidige veksten av hjernebarken ^8.

Mange genetiske mutasjoner har blitt identifisert som forstyrrer ulike aspekter ved kortikal utvikling ^9. Kortikal utvikling kan også bli negativt påvirket av eksponering for inntatte giftstoffer som kokain ¹⁰ og alkohol ^11. Fordi kortikale misdannelser som oppstår under utviklingen er sannsynlig bidragsytere til nevrologiske lidelser (f.eks autisme, schizofreni), empiriske undersøkelser av forstyrrelser til hjernebarken er iboendely viktig. Det er derfor av stor betydning å etablere metoder for å studere kortikal utvikling som tillater raske analyser av genetiske eller toksin effekter, men som også bevare de mulige interaksjoner mellom differensierende nevroner, andre celletyper og ekstracellulære matrix (ECM) under denne tidlige perioden av hjernens utvikling ¹² .

Slice explants ¹³ har gitt et slikt system, og har vært mye brukt til analysen kortikale nevroner utvikling ^14-16. Imidlertid kan slice analyser lider ulempe at neuronal migrasjon og laminering kan være unormal ¹⁷ muligens på grunn av skader på meningeal celler som omgir hjerne i utvikling og feste radial glial stillaset. Som radial glial fiber er en viktig substrat for cortical neuron migrasjon ¹⁸ forstyrrelse av basal lamina ved å skjære kan lokalt forstyrre radial glial arkitektur og føre til endret cortical migrasjon. I tillegg SLICED flater eksplanter gir en region av døde celler som kan endre normal sammensetning av ECM i disse områdene.

Nyere tilnærminger har fokusert sin analyse på celler lokalisert dypt i sektoren som er omgitt av egnede sunne celletyper og ECM. Imidlertid, i noen tilfeller disse nyere tilnærmingene kan kreve at den opprinnelige tykk cultured skive være Cryo-seksjonert eller parafin-delt etter fiksering slik at forholdsvis normal indre av stykket er gjort tilgjengelig for analyse ^19-21. Både den opprinnelige vibratome seksjonering å forberede live skiver for kultur samt påfølgende cryosectioning av faste skiver for analyse krever omsorg og innsats for disse analysene for å fungere.

Å gi en enkel, utfyllende tilnærming for studier av tidlig kortikal utvikling, har vi endret en eksisterende slice tilnærminger ¹³ til rette for studier av tidlig kortikal utvikling. Vi har utviklet en whole halvkule eksplantering modell lik en eksisterende E14 hele halvkule modell som er involvert risting kulturer på 65 omdreininger i minuttet og tillatt organotypic vekst for 16-18 hr ^22,23. I vår tilnærming, er hele halvkule eksplanter plassert på semi-permeabel membran ¹³ med i en høy oksygen kultur atmosfære ^21,24 å utvide organotypic kortikal vekst i 48 timer. Denne tilnærmingen gjør det også for konsekvent electroporation for å utvikle kortikale nevroner. Embryoene fjernes fra livmoren og electroporated å introdusere plasmid DNA og telencephalon deretter dissekert. Hver halvkule er isolert og plassert medial side ned på en kollagen-belagt filter. Den eksplantasjon blir deretter dyrket i et tidsrom på 48 timer, en periode som omfatter preplate splitting ^8. Under kulturperiode, L6 neurons utvikles fra forløper til differensiert ²⁵ nevron, fullstendig plassert innenfor kortikale plate. Gjennom denne perioden utviklernevron er omgitt av den aktuelle ECM og celletyper som ville konfrontere tilsvarende celle in vivo. Dette systemet har allerede vist verdifulle i å tyde den cellulære hendelser som ligger til grunn etanol toksisitet ^26, 6 lag dannelse og preplate ^7,25 splitting.

Protocol

1. Tidligere utero Electroporations med grønt fluorescerende protein ekspresjonsplasmid Plasmid DNA injeksjonsoppløsninger er forberedt med CAG-eGFP DNA 27 fortynnet til den endelige arbeidskonsentrasjon på 0,33 mg / ml i DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-preps brukes til å rense plasmid fra transformerte bakterier. Rask grønt fargestoff ved ~ 0,02% (w / v final) tilsettes til DNA-løsningen som en injeksjon tracer. For å forberede den kirurgiske området, spyl benk…

Representative Results

Embryonale gnager cortex viser en tverrgående neurogenetic gradient gjennom hele utviklingsperioden, er slik at lateral neocortex ca 1 dag mer moden enn dorsal medial neocortex 28. Hoveddelen av laget 6 nevroner dermed generert (dvs. oppviser sin endelige S-fase) på E12 i lateral cortex (også kalt Field 40 5) og ved E13 i dorsal medial cortex (også kalt Felt 1 5). Preplate splitting begynner ca 1 dag etter lag 6 neuron generasjon og dermed startes i den laterale cortex på E…

Discussion

Vi har forbedret og evaluert en eksperimentell modell – hele halvkule explants – for studiet av tidlig kortikal utvikling (E13-E15). Modellen har vist seg nyttig for analyse av migrering og differensiering av den eksitatoriske nervecellen avstamning som utgjør sjikt 6 av hjernebarken ^25,37. Prinsippet fordelene med systemet er 1) organotypic vekst for 2 DIV, 2) enkelhet forberedelse, og 3) eksperimentell tilgang til nervecellene for elektroporering, farmakologisk manipulasjon og avbildning i denne tidlige, k…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments (optional)
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Culture insert collagen coated	Costar	3492
Bovine skin gelatin	Sigma	G9382
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Bovine Serum Albumin	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Tweezer electrodes 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubator	Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton syringe (5 uL)	Hamilton	87930
Hamilton syringe needle	Hamilton	7803-04	Specify 1″ and style 4
Dumont #5 Forceps	FST	11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm	FST	14058-09