पूर्व utero electroporation और पूरे गोलार्ध explants: प्रारंभिक Cortical विकास के अध्ययन के लिए एक सरल प्रयोगात्मक विधि
Summary
इस प्रोटोकॉल में शामिल है कि एक बेहतर explant प्रक्रिया का वर्णन<em> पूर्व utero</em> Electroporation, और भ्रूण माउस से पूरे मस्तिष्क गोलार्द्धों के विच्छेदन की संस्कृति. तैयारी जल्दी cortical विकास के दौरान औषधीय अध्ययन और जीन समारोह की assays की सुविधा है.
Abstract
Cortical विकास न्यूरॉन्स और अग्रदूत साबित कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं, meninges और संबद्ध बाह्य मैट्रिक्स सहित गैर neuronal तत्वों के बीच जटिल बातचीत शामिल है. क्योंकि वे एक उपयुक्त organotypic वातावरण प्रदान करते हैं, cortical टुकड़ा explants अक्सर उन मुलाकातों है कि neuronal भेदभाव और विकास नियंत्रण की जांच करने के लिए किया जाता है. लाभकारी हालांकि, टुकड़ा explant मॉडल न्यायपालिका सेलुलर फाड़ना और माइग्रेशन सहित खामियों से ग्रस्त कर सकते हैं. यहाँ हम एक पूरी जल्दी cortical विकास है कि cortical स्लाइस और शो लगातार organotypic प्रवास और फाड़ना की तुलना में आसान करने के लिए तैयार है के अध्ययन के लिए मस्तिष्क गोलार्द्ध explant प्रणाली रिपोर्ट. इस मॉडल प्रणाली में, जल्दी फाड़ना और प्रवास पैटर्न इन विट्रो में दो दिन की अवधि के लिए सामान्य रूप से आगे बढ़ना है, preplate बंटवारे की अवधि के दौरान जो भावी cortical परत छह रूपों. हम तो एक पूर्व utero electroporation (EUEP) विकसितदृष्टिकोण है कि ~ पृष्ठीय औसत दर्जे का प्रांतस्था में विकसित न्यूरॉन्स GFP अभिव्यक्ति लक्ष्यीकरण में 80% सफलता प्राप्त करता है.
पूरे गोलार्द्ध explant मॉडल जल्दी cortical electroporation, औषधीय हस्तक्षेप और रहते इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए सुलभ विकास बनाता है. इस विधि अस्तित्व utero electroporation (IUEP) दृष्टिकोण में जबकि दोनों अभिकर्मक और areal लक्ष्यीकरण स्थिरता में सुधार के लिए जरूरी सर्जरी से बचा जाता है. इस विधि neuronal प्रवास, प्रसार और भेदभाव की प्रयोगात्मक अध्ययन की सुविधा होगी.
Introduction
स्तनधारी ठोस प्रसार, प्रवास और क्रमिक उत्पन्न न्यूरॉन्स की भेदभाव के माध्यम से मस्तिष्क प्रांतस्था रूपों. प्रत्येक न्यूरॉन वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZ) में पैदा होता है और मध्यवर्ती क्षेत्र (IZ) में VZ से migrates, cortical प्लेट (सीपी) 1 बनाने. के रूप में वे विभिन्न cortical डोमेन के माध्यम से गुजरती हैं, ओर पलायन न्यूरॉन्स 2,3 प्रवास के कई मोड जो कोशिकी विकसित ऊतक के भीतर पर्यावरण अन्य सेलुलर तत्वों (जैसे रेडियल glia) पर निर्भर प्रदर्शन. Cortical न्यूरॉन्स तो neuronal प्रवास गिरफ्तारी और dendritogenesis 4 संपाती प्रक्रियाओं में गठन cortical थाली के शीर्ष पर प्रवास गिरफ्तारी.
Cortical विकास भ्रूण 11-13 (E11-13) मौलिक उलझन – रूप परत 6 या preplate (पीपी), अग्रणी न्यूरॉन्स की कि overlies VZ परत की स्थापना के माध्यम से 5 दिनों के बीच शुरू की है. भावीपरत 6 cortical (यानी 1 cortical VZ में पैदा हुआ न्यूरॉन्स) तो पूरबी एक टकसाली पैटर्न में अपने somata और 7 पीपी के भीतर एक अलग परत में सम्मिलित न्यूरॉन्स. इन घटनाओं को एक सतही सीमांत (भविष्य cortical परत 1) और एक गहरी क्षेत्र, subplate कोशिकाओं (क्षणिक cortical परत 7) के बाद में preplate विभाजित. इस प्रक्रिया, preplate बंटवारे करार दिया, मस्तिष्क प्रांतस्था 8 के भविष्य के विकास में एक मूलभूत घटना है.
कई आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान है कि cortical 9 विकास के विभिन्न पहलुओं को बाधित किया गया है. Cortical विकास भी नकारात्मक 10 कोकीन और 11 शराब के रूप में किया जाता विषाक्त पदार्थों को जोखिम से प्रभावित किया जा सकता है. क्योंकि cortical विरूपताओं है कि विकास के दौरान उत्पन्न होने की संभावना स्नायविक विकारों (जैसे एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित) योगदान कर रहे हैं, cortical विकास perturbations की प्रायोगिक जांच निहित हैंमहत्वपूर्ण ly. इसलिए यह काफी महत्व के दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए cortical विकास के है कि आनुवंशिक या विष प्रभाव के तेजी से assays अनुमति है, लेकिन है कि मस्तिष्क विकास 12 के इस प्रारंभिक अवधि के दौरान भी फर्क न्यूरॉन्स, अन्य प्रकार सेल और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच संभव बातचीत की रक्षा का अध्ययन .
स्लाइस 13 explants एक ऐसी प्रणाली प्रदान की है और व्यापक रूप से परख cortical न्यूरॉन 14-16 विकास के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, टुकड़ा assays दोष यह है कि neuronal प्रवास और फाड़ना असामान्य 17 संभवतः मस्तिष्कावरणीय कोशिकाओं है कि चारों ओर विकासशील मस्तिष्क और लंगर रेडियल glial पाड़ को नुकसान की वजह से ग्रस्त कर सकते हैं. के रूप में रेडियल glial फाइबर टुकड़ा करने की क्रिया के द्वारा एक बेसल लामिना का cortical न्यूरॉन प्रवास 18 विघटन के लिए महत्वपूर्ण सब्सट्रेट स्थानीय रेडियल glial वास्तुकला को बाधित कर सकते हैं और बदल cortical प्रवास करने के लिए नेतृत्व. Sli अलावाexplants के ced सतहों मृत कोशिकाओं का एक क्षेत्र है कि इन क्षेत्रों में ईसीएम के सामान्य संरचना बदल सकता है प्रदान करता है.
अधिक हाल ही में दृष्टिकोण टुकड़ा है कि उपयुक्त स्वस्थ कोशिका प्रकार और ECM से घिरे रहे हैं में गहरी स्थित कोशिकाओं पर अपने विश्लेषण ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, कुछ मामलों में इन नए दृष्टिकोण की आवश्यकता कर सकते हैं कि मूल मोटी सुसंस्कृत टुकड़ा निर्धारण के बाद क्रायो sectioned या आयल – sectioned इतना है कि टुकड़ा अपेक्षाकृत सामान्य इंटीरियर 19-21 विश्लेषण के लिए उपलब्ध कराया जाता है. दोनों मूल रूप में के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण के लिए निश्चित स्लाइस के बाद cryosectioning संस्कृति के लिए जीना स्लाइस तैयार सेक्शनिंग vibratome देखभाल और इन assays के लिए काम करने के लिए प्रयास करने की आवश्यकता है.
लिए एक सरल, जल्दी cortical विकास के अध्ययन के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, हम एक मौजूदा टुकड़ा दृष्टिकोण 13 को संशोधित किया है जल्दी cortical विकास के अध्ययन की सुविधा. हम विकसित किया है एक कole गोलार्द्ध explant एक मौजूदा E14 पूरे गोलार्द्ध मॉडल है कि प्रति मिनट 65 rotations और 16-18 22,23 घंटे के लिए अनुमति दी organotypic विकास मिलाते संस्कृतियों को शामिल करने के लिए इसी तरह के मॉडल. हमारे दृष्टिकोण में, पूरे गोलार्द्ध explants अर्द्ध पारगम्य झिल्ली 13 पर एक उच्च ऑक्सीजन संस्कृति 21,24 वातावरण में रखा जाता है के लिए 48 घंटे के लिए organotypic cortical विकास का विस्तार. यह दृष्टिकोण भी cortical न्यूरॉन्स के विकास के अनुरूप electroporation के लिए अनुमति देता है. भ्रूण गर्भाशय से हटा रहे हैं और प्लास्मिड डीएनए शुरू electroporated और telencephalon तो dissected है. प्रत्येक गोलार्द्ध अलग है और औसत दर्जे का पक्ष एक कोलेजन लेपित फिल्टर पर नीचे रखा. explant तो 48 घंटा, एक अवधि है कि preplate 8 बंटवारे शामिल की एक अवधि के लिए संवर्धित है. संस्कृति अवधि के दौरान, L6 न्यूरॉन्स अग्रदूत से cortical प्लेट के भीतर विभेदित न्यूरॉन 25, सही ढंग से तैनात करने के लिए विकसित करना. इस अवधि के विकासशील के दौरानन्यूरॉन उपयुक्त ECM और कोशिका प्रकार है कि vivo में इसी सेल का सामना से घिरा हुआ है. यह प्रणाली पहले से ही सेलुलर घटनाओं है कि इथेनॉल 26 विषाक्तता, परत 6 गठन और preplate 7,25 बंटवारे आबाद गूढ़ रहस्य में मूल्यवान साबित कर दिया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सुधार हुआ है और एक प्रयोगात्मक मॉडल का मूल्यांकन जल्दी cortical विकास के अध्ययन के लिए (E13 E15) – पूरे गोलार्द्ध explants. मॉडल और उत्तेजक न्यूरॉन वंश के मस्तिष्क प्रांतस्था 25,37 6 परत का गठन के प्रवास भेदभाव के वि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम (NS066071) NINDS और NIAAA से अनुदान समर्थित किया गया. (P50AA017823) ईसीओ. लेखक डॉ. रॉबर्ट क्विन और जानवरों की देखभाल के लिए प्रयोगशाला के पशु संसाधन विभाग में कर्मचारियों धन्यवाद. हम तकनीकी समर्थन के लिए Judson Belmont धन्यवाद, एक ग्रीष्मकालीन अंडर रिसर्च फैलो (सर्फ) के रूप में सहायता के लिए निकोल Belletier. हम भी टिप्पणी के लिए धन्यवाद डॉ. डेविड कैमरून और पांडुलिपि के पहले के एक संस्करण पर संपादन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
