Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d'imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus
Summary
Nous décrivons une méthode reproductible de préparation de cellules acineuses pancréatiques de souris à partir d'une souris dans le but d'examiner les signaux calciques des cellules acineuses et des lésions cellulaires avec physiologiquement et pathologiquement stimuli pertinents. Une méthode d'infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.
Abstract
Les cellules acineuses du pancréas est la principale cellule parenchymateuse du pancréas exocrine et joue un rôle primordial dans la sécrétion d'enzymes pancréatiques dans le canal pancréatique. Il est également le site pour l'initiation d'une pancréatite. Nous décrivons ici comment les cellules acineuses sont isolés de signaux intracellulaires de calcium tout le tissu du pancréas et sont mesurées. En outre, nous décrivons les techniques de transfection de ces cellules avec des constructions adénoviraux, et mesurer ensuite la fuite de lactate déshydrogénase, un marqueur de lésion des cellules, dans des conditions qui induisent des lésions des cellules acineuses in vitro. Ces techniques constituent un outil puissant pour caractériser la physiologie des cellules acineuses et la pathologie.
Introduction
Changements dynamiques de calcium cytosolique sont nécessaires pour les événements de cellules acineuses la fois physiologiques et pathologiques. Ces effets divergents de calcium sont censés résulter de configurations spatiales et temporelles distinctes de la signalisation calcique 1. Par exemple, une enzyme et la sécrétion d'un fluide à partir de la cellule des cellules acineuses sont liés à des pics de calcium à partir d'une région limitée du pôle apical où la sécrétion a lieu 2. En revanche, une vague de calcium global, suivi par des signaux calciques non oscillatoires intense est associé à des événements pathologiques précoces qui conduisent à une pancréatite aiguë 3,4. Il s'agit notamment de l'activation intra-acinaire protéase, la sécrétion de l'enzyme réduite, et la lésion des cellules acineuses. Notre laboratoire utilise isolé acini pancréatiques pour étudier ces événements pathologiques précoces qui conduisent à la maladie à la fois in vivo et in vitro 5-7. Les méthodes décrites ci-dessous décrivent l'isolement des cellules acineuses primaires dans le but de mesurer cyles niveaux de calcium tosolic et lésions cellulaires. Une méthode d'infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode d'isolement cellulaire et des essais ultérieurs décrits ici sont des outils puissants pour étudier les caractéristiques physiologiques et physiopathologiques du pancréas exocrine. La méthode pour isoler des cellules acineuses dispersées a été décrite par Amsterdam et Jamieson en 1972 11. Les méthodes présentées ici ont été adaptés à partir de méthodes d'isolement plus récents décrits par Van Acker et ses collègues 12. Bien que ces techniques sont hautement r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health Grant DK083327 et DK093491 (à SZH).
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |
References
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