Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral

Summary

Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.

Abstract

As células acinares do pâncreas é a principal célula do parênquima do pâncreas exócrino e desempenha um papel primordial na secreção de enzimas pancreáticos no ducto pancreático. É também o local para o início da pancreatite. Aqui, nós descrevemos como células acinares são isolados a partir de sinais de cálcio intracelular tecido e pâncreas todo são medidos. Além disso, descrevem-se as técnicas de transfecção destas células com as construções adenovirais, e, subsequentemente, medindo a fuga de lactato desidrogenase, um marcador de lesão da célula, em condições que induzem a lesão das células acinares, in vitro. Estas técnicas proporcionam uma ferramenta poderosa para caracterizar acinar celular fisiologia e patologia.

Introduction

Estas alterações dinâmicas em cálcio intracelular são necessárias para os eventos de células acinares tanto fisiológicos e patológicos. Estes efeitos divergentes de cálcio são pensados ​​para resultar de padrões espaciais e temporais distintos de cálcio de sinalização ^1. Por exemplo, a enzima e a secreção de fluido a partir da célula acinar estão ligadas a pontos do cálcio a partir de uma região limitada do pólo apical onde ocorre a secreção de ^2. Em contraste, uma onda de cálcio global seguida de sinais de cálcio não-oscilatórias intensas está associada com eventos patológicos iniciais que conduzem a pancreatite aguda ^3,4. Estes incluem a ativação intra-acinar protease, a secreção de enzimas reduzida e lesão celular acinar. O nosso laboratório utiliza isolado ácinos pancreáticos de estudar estes eventos patológicos iniciais que conduzem a doença, tanto in vivo como in vitro ^5-7. Os métodos descritos aqui descrevem o isolamento de células acinares primárias com a finalidade de medir cyníveis de cálcio tosolic e lesão celular. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.

Protocol

1. Preparando células pancreáticas acinares para Imagem de cálcio Preparar tampão de incubação contendo HEPES a 20 mM HEPES, 95 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucose, 2 mM de glutamina e 1 × aminoácidos não essenciais do meio mínimo de Eagle. Ajuste da solução final a pH 7,4 com NaOH. Preparar um tampão de incubação de BSA por adição de BSA (1% w / v final) a 25 ml de tampão de incubação de HEPES (descrito acima). …

Representative Results

Um exemplo de medições de cálcio de células acinares, em resposta a estímulos fisiológicos é fornecido na Figura 3. As células acinares foram carregados com o corante Fluo-cálcio 4 e perfundido com a acetilcolina análogo carbacol (CCh, 1 uM)) 8. Células reagiu, sob a forma de uma onda de cálcio, que tem início na região apical e propaga à região basolateral de 3,9. Traçados representativos mostrados na Figura 3B mostram o padrão típico de pico-pl…

Discussion

O método de isolamento de células e ensaios subseqüentes descritos aqui representam poderosas ferramentas com as quais estudam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do pâncreas exócrino. O método de isolamento de células pancreáticas acinares dispersas foi descrita pela primeira vez por Amesterdão e Jamieson, em 1972, ^11. Os métodos aqui apresentados foram adaptados a partir de métodos de isolamento mais recentes descritos por Van Acker e colegas ^12. Embora estas técnicas são a…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110