Опишем воспроизводимый способ получения мышь ацинарных клетках поджелудочной железы у мыши с целью изучения ацинарных клетки кальция сигналов и повреждение клеток с физиологически и патологически соответствующие стимулы. Способ аденовирусной инфекции этих клеток также предоставляется.
Клетки поджелудочной ацинарным является основной паренхимы клетки поджелудочной железы внешней секреции и играет главную роль в секреции ферментов поджелудочной железы в проток поджелудочной железы. Это также место для начала панкреатита. Здесь мы описываем ацинарных клеток выделяют из цельной ткани поджелудочной железы и внутриклеточных сигналов кальция измерены. Кроме того, мы описываем методы трансфекции эти клетки с аденовирусные конструкции, а затем измерение утечки лактатдегидрогеназы, маркер повреждения клеток, при условиях, которые индуцируют ацинарных повреждение клеток в пробирке. Эти методы обеспечивают мощный инструмент для характеристики ацинарным клеточной физиологии и патологии.
Динамические изменения в цитозольного кальция являются необходимыми для физиологических и патологических событий ацинарных клетки. Эти различные эффекты кальция, как полагают, в результате различных пространственных и временных форм сигналов кальция 1. Например, фермент и секрецию жидкости из ацинарных клеток связаны с кальцием шипы из ограниченной области апикального полюса, где секреции происходит 2. В отличие от глобальной волны кальция последующим интенсивным неколебательных сигналов кальция связан с ранним патологических событий, которые ведут к остром панкреатите 3,4. Они включают в себя внутри-ацинарным активации протеаз, снижение секреции ферментов и повреждение ацинарным клетки. Наша лаборатория использует изолированы ацинусов поджелудочной железы для изучения этих ранних патологических событий, которые приводят к болезни как в естественных условиях и в пробирке 5-7. Методы подробно описаны здесь описаны выделение первичной ацинарных клетках с целью измерения суtosolic уровни кальция и повреждение клеток. Способ аденовирусной инфекции этих клеток также предоставляется.
Способ выделения клеток и последующего анализа изображен здесь представляют собой мощные инструменты, с которыми изучать физиологические и патофизиологические особенности экзокринной поджелудочной железы. Способ выделения дисперсных ацинарных клетках поджелудочной железы был вп?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Грант DK083327 и DK093491 (в СЖ).
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase | Worthington | 4188 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
Deionized water | N/A | N/A | |
18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
Equipment | |||
Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |