Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral
Summary
Descriviamo un metodo riproducibile di preparazione del mouse pancreatiche cellule acinose da un mouse con lo scopo di esaminare i segnali di calcio delle cellule acinose e lesioni cellulari con stimoli fisiologicamente e patologicamente rilevanti. Viene inoltre fornito un metodo per l'infezione adenovirale di queste cellule.
Abstract
L'cellule acinose pancreatiche è il principale parenchima cellulare del pancreas esocrino e svolge un ruolo primario nella secrezione di enzimi pancreatici nel dotto pancreatico. E 'anche il sito per l'avvio di pancreatite. Qui si descrive come le cellule acinose sono isolati da tutto il tessuto del pancreas e dei segnali intracellulari di calcio sono misurati. Inoltre, si descrivono le tecniche di trasfezione queste cellule con costrutti adenovirali, e successivamente misurando la fuoriuscita di lattato deidrogenasi, un marker di danno cellulare, in condizioni che inducono lesioni cellule acinose in vitro. Queste tecniche forniscono un potente strumento per la caratterizzazione delle cellule acinose fisiologia e patologia.
Introduction
Cambiamenti dinamici nel calcio citosolico sono necessari per gli eventi delle cellule acinose sia fisiologiche che patologiche. Questi effetti divergenti di calcio sono pensati per derivare da diversi modelli spaziali e temporali di calcio di segnalazione 1. Per esempio, enzimi e la secrezione fluido dalla cellule acinose sono legate a picchi di calcio da una regione ristretta del polo apicale in cui la secrezione avviene 2. Al contrario, un'onda calcio globale seguito da intensi segnali di calcio non-oscillatorie è associato ad eventi patologici precoci che portano alla pancreatite acuta 3,4. Questi includono attivazione intra-acinare proteasi, enzima secrezione ridotta e danno cellulare acinare. Il nostro laboratorio utilizza isolato acini pancreatici per studiare questi eventi patologici precoci che portano alla malattia, sia in vivo che in vitro 5-7. I metodi qui descritti descrivono isolamento di cellule acinose primarie a scopo di misurare cylivelli di calcio tosolic e lesioni delle cellule. Viene inoltre fornito un metodo per l'infezione adenovirale di queste cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di isolamento delle cellule e saggi successivi raffigurati qui rappresentano potenti strumenti con cui studiare le caratteristiche fisiologiche e fisiopatologiche del pancreas esocrino. Il metodo per isolare le cellule acinose pancreatiche dispersi è stato descritto da Amsterdam e Jamieson nel 1972 11. I metodi qui presentati sono stati adattati da più recenti metodi di isolamento descritte da Van Acker e colleghi 12. Sebbene queste tecniche sono altamente riproducibili e facilmente app…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health di Grant DK083327 e DK093491 (a CSPS).
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |
References
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