칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비
Summary
우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.
Abstract
췌장 포상 세포 외분비 췌장의 주요 실질 세포이며, 췌장 덕트로 췌장 효소의 분비에 주요 역할을한다. 또한 췌장염의 시작을위한 사이트입니다. 여기에서 우리는 전체 췌장 조직과 세포 내 칼슘 신호의 포상 세포가 고립되는 방법을 설명하는이 측정됩니다. 또한, 우리는 체외에서 포상 세포 손상을 유발 조건에서, 아데노 바이러스 구조와 이들 세포를 형질, 이후 젖산 탈수소 효소, 세포 손상의 마커의 누설을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 포상 세포 생리학 및 병리학의 특성을 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
세포질 칼슘의 동적 변화는 생리적, 병리 모두 포상 세포 이벤트가 필요합니다. 칼슘이 발산 효과는 1 신호 칼슘의 독특한 공간과 시간적 패턴의 결과로 생각된다. 예를 들어, 포상 세포에서 효소 액의 분비는 분비 곳이 소요 혀끝 극의 제한된 지역에서 칼슘 스파이크로 연결됩니다. 대조적으로, 강한 비 진동 칼슘 신호에 의해 다음 글로벌 칼슘 파 급성 췌장염 3,4로 이어질 초기 병리학 적 사건과 연관됩니다. 이러한 내부 포상 단백 분해 효소 활성 감소, 효소 분비 및 포상 세포 손상이 (가) 있습니다. 우리 연구실은 생체 내 5-7 체외에서 두 질병으로 이어질 이러한 초기 병적 인 이벤트를 공부 고립 췌장암 acini를 사용합니다. 여기에 설명 된 방법은 CY 측정의 목적을 위해 기본 포상 세포의 분리 기술tosolic 칼슘 수준과 세포 손상. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.
Protocol
1. 칼슘 이미징을위한 췌장 포상 세포를 준비 20 MM의 HEPES 95 mM의 NaCl을 4.7 mM의 KCl을, 0.6 mM의 MgCl 2, 1.3 MM의 염화칼슘, 10 mM의 포도당, 2 MM의 글루타민, 1 × 최소 이글의 중간 비 필수 아미노산을 포함하는 HEPES 배양 버퍼를 준비합니다. NaOH를 pH를 7.4로 최종 솔루션을 조정합니다. HEPES 배양 버퍼 (위에서 설명)의 25 ML에 BSA (1 % W / V 최종)를 추가하여 BSA 배양 버퍼를 준비합?…
Representative Results
생리적 자극에 응답 포상 세포의 칼슘 측정의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 포상 세포는 칼슘에 의해로드 된 염료 플루오 4 아세틸 콜린 아날로그 carbachol (CCH, 1 μM)로 관류) 8. 세포는 혀끝의 지역에서 시작하고 기저 영역 3,9에 전파 칼슘 파의 형태로 반응했다. 그림 3b에서와 같이 대표 표목은 일반적으로 1 μM의 carbachol 관찰 전형적인 피크 고원 패턴을 보?…
Discussion
세포 분리 방법과 이후의 분석은 외분비 췌장의 생리적 및 병리 적 특징을 연구하는 강력한 도구를 나타냅니다 여기 아닙니다. 분산 췌장 포상 세포를 분리하는 방법은 1972 년 11 암스테르담 제이미 슨에 의해 설명되었다. 여기에 제시된 방법은 반 애커와 동료 (12)에 의해 설명 최근 분리 방법에서 적응되었다. 이러한 기술은 높은 재현성 쉽게 배울 수 있지만, 정확하게 수행해야합…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 DK083327 및 DK093491의 국립 연구소 (SZH까지)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |
References
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Cite This Article
Orabi, A. I., Muili, K. A., Wang, D., Jin, S., Perides, G., Husain, S. Z. Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection. J. Vis. Exp. (77), e50391, doi:10.3791/50391 (2013).