कैल्शियम इमेजिंग का प्रयोजन, सेल चोट माप, और adenoviral संक्रमण के लिए अग्नाशय कोष्ठकी कक्ष की तैयारी
Summary
हम physiologically और विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक उत्तेजनाओं के साथ कोष्ठकी सेल कैल्शियम संकेतों और सेलुलर चोट की जांच करने के प्रयोजन के लिए एक माउस से माउस अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की तैयारी की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन है. इन कोशिकाओं के adenoviral संक्रमण के लिए एक विधि को भी प्रदान की जाती है.
Abstract
अग्नाशय कोष्ठकी सेल बहि अग्न्याशय के मुख्य parenchymal सेल है और अग्नाशय वाहिनी में अग्नाशय एंजाइमों के स्राव में एक प्राथमिक भूमिका निभाता है. यह भी अग्नाशयशोथ की दीक्षा के लिए साइट है. यहाँ हम पूरे अग्न्याशय के ऊतकों और intracellular कैल्शियम संकेतों से कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं वर्णन कैसे मापा जाता है. इसके अलावा, हम इन विट्रो में कोष्ठकी सेल चोट प्रेरित है कि शर्तों के दौरान, adenoviral निर्माणों के साथ इन कोशिकाओं transfecting, और बाद में लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज, सेल चोट के एक मार्कर के रिसाव को मापने की तकनीक का वर्णन है. इन तकनीकों में कोष्ठकी सेल फिजियोलॉजी और विकृति को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं.
Introduction
साइटोसोलिक कैल्शियम में गतिशील परिवर्तन शारीरिक और रोग दोनों कोष्ठकी सेल घटनाओं के लिए आवश्यक हैं. कैल्शियम की ये भिन्न प्रभाव 1 संकेतन कैल्शियम की अलग स्थानिक और लौकिक पैटर्न से परिणाम माना जाता है. उदाहरण के लिए, कोष्ठकी सेल से एंजाइम और तरल पदार्थ का स्राव स्राव जगह 2 लेता है जहां शिखर ध्रुव के एक प्रतिबंधित क्षेत्र से कैल्शियम spikes के लिए जुड़े हुए हैं. इसके विपरीत, तीव्र गैर oscillatory कैल्शियम संकेतों के बाद वैश्विक कैल्शियम लहर तीव्र pancreatitis 3,4 नेतृत्व करने के लिए जो जल्दी रोग की घटनाओं के साथ जुड़ा हुआ है. ये अंतर कोष्ठकी प्रोटीज सक्रियण, कम एंजाइम स्राव, और कोष्ठकी सेल चोट शामिल हैं. हमारी प्रयोगशाला vivo में और 5-7 इन विट्रो में दोनों रोग को जन्म दे जो इन जल्दी रोग की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अलग अग्नाशय acini का उपयोग करता है. यहाँ विस्तृत तरीकों cy मापने के उद्देश्य से प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव का वर्णनtosolic कैल्शियम का स्तर और सेल चोट. इन कोशिकाओं के adenoviral संक्रमण के लिए एक विधि को भी प्रदान की जाती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल अलगाव विधि और बाद assays के बहि अग्न्याशय के शारीरिक और pathophysiological सुविधाओं का अध्ययन करने के साथ जो शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व यहां दर्शाया. छितरी अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान DK083327 और DK093491 का एक राष्ट्रीय संस्थान (SZH के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
| Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | 4188 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
| Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
| Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
| Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
| Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
| Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
| Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
| 48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
| 96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
| 6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
| Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
| Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
| Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
| Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
| Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |
References
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
