Vi beskriver en reproduserbar fremgangsmåte for fremstilling av mus acinøse celler fra en mus med det formål å undersøke acinøse celler kalsium signaler og cellulær skade med fysiologisk og patologisk relevante stimuli. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.
Den acinøse celle er den viktigste parenchymal celle av den eksokrine pankreas og spiller en primær rolle i utskillelsen av pankreas enzymer inn i bukspyttkjertelen kanal. Det er også stedet for oppstart av pankreatitt. Her beskriver vi hvordan akinærceller er isolert fra hele bukspyttkjertelen vev og intracellulære kalsium signaler måles. I tillegg, beskriver vi teknikker for å transfektere disse cellene med adenovirus-konstruksjoner, og deretter måling av lekkasje av laktatdehydrogenase, en markør for celleskade, under betingelser som induserer acinøs celleskade in vitro. Disse teknikkene gir et kraftig verktøy for å karakterisere acinar celle fysiologi og patologi.
Dynamiske endringer i cytosolic kalsium er nødvendig for både fysiologiske og patologiske acinøse celler hendelser. Disse divergerende virkninger av kalsium er antatt å resultere fra forskjellige romlige og temporale mønstre av kalsium signalisering en. For eksempel er enzymet og utskillelse fra cellen acinøs knyttet til kalsium pigger fra et begrenset område av den apikale pol hvor utskillelsen finner sted to. I kontrast er en global kalsium bølge etterfulgt av intens ikke-oscillasjon kalsium signaler forbundet med tidlige patologiske hendelser som fører til akutt pankreatitt 3,4. Disse inkluderer intra-acinar protease aktivering, redusert enzym sekresjon, og acinar celleskade. Laboratoriet benytter isolert pankreatisk acini å studere disse tidlige patologiske hendelser som fører til sykdom både in vivo og in vitro 5-7. Metodene beskrevet her beskriver isolering av primære akinærceller for det formål å måle cytosolic kalsiumnivå og celle skade. En fremgangsmåte for adenoviral infeksjon av disse celler er også tilveiebrakt.
Cellen isolasjon metode og påfølgende analyser avbildet her representerer kraftige verktøy som brukes til å studere fysiologiske og patofysiologiske trekk ved eksokrin pankreas. Metoden for å isolere spredt acinøse celler ble først beskrevet av Amsterdam og Jamieson i 1972 11. Metodene som presenteres her har blitt tilpasset fra nyere isolasjon metoder beskrevet av Van Acker og kolleger 12. Selv om disse teknikkene er meget reproduserbart og lett lært, er det flere viktige funksjoner til hv…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en National Institutes of Health DK083327 Grant, og DK093491 (til SZH).
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice | NCI | N/A | Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results. |
HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M-8266 | |
Calcium Chloride | Fischer | C79 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
1X minimum Eagle’s medium non-essential amino acid mixture | Gibco | 11140-050 | |
Sodium Hydroxide | EM | SX0593 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase | Worthington | 4188 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T-9003 | |
Carbon Dioxide | Matheson Gas | 124-38-9 | |
125 ml Erlenmeyer plastic flask | Crystalgen | 26-0005 | |
Dissection kit | Fine Science Tools | 14161-10 | |
70% Ethanol | LabChem | LC222102 | |
P1000, P100, P10 pipettes | Gilson | FA10005P | |
Weighing boat | Heathrow Scientific | HS1420A | |
Plastic transfer pipettes | USA Scientific | 1020-2500 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml micro-centrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
0.65 ml micro-centrifuge tube | VWR | 20170-293 | |
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher | 032811-9 | |
Nitric Acid | Fischer | A483-212 | |
Hydrochloric Acid | Fischer | A142-212 | |
Deionized water | N/A | N/A | |
18 x 18 mm coverslips | Fischer | 021510-9 | |
Laboratory film | Parafilm | PM-996 | |
Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
60 ml syringe | BD Bioscience | DG567805 | |
23 ¾ gauge needle | BD Bioscience | 9328270 | |
PE50 tubing | Clay Adam | PE50-427411 | |
Flat head screwdriver | N/A | N/A | |
DMEM F-12, no Phenol Red | Gibco | 21041-025 | |
30.5 gauge needle | BD Bioscience | 305106 | |
5 CC syringe | BD Bioscience | 309603 | |
25 ml Erlenmeyer flask | Fischer | FB50025 | |
Nylon mesh filter | Nitex | 03-150/38 | 150 μm pore size |
48 well tissue culture plate | Costar | 3548 | |
96 well tissue culture plate | Costar | 3795 | |
6 well tissue culture plate | Costar | 3506 | |
Liquid nitrogen | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
Cytotoxicity assay kit | Promega | G1782 | |
Adeno-GFP | N/A | N/A | Gift from J. Williams |
Equipment | |||
Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
Perifusion chamber | N/A | N/A | Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University |
Vacuum line | Manostat | 72-100-000 | |
Water bath with shaker | Precision Scientific | 51220076 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | 11-120-534 | |
Tissue culture hood | Nuaire | NU-425-600 | |
Tissue culture Incubator | Thermo | 3110 |