Summary
हम यहाँ इन विट्रो में ग्लाइकोजन का अनुमापन के लिए एक सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुविधाजनक जैव रासायनिक विधि का वर्णन. इस तकनीक Abcam ग्लाइकोजन परख किट का उपयोग करता है और प्रतिदीप्ति द्वारा अनुमापन ग्लूकोज और ग्लूकोज को ग्लाइकोजन की लगातार हाइड्रोलिसिस पर आधारित है.
Abstract
ग्लाइकोजन हड्डीवाला जानवरों में ग्लूकोज का मुख्य ऊर्जावान बहुलक है और एक महत्वपूर्ण पूरे शरीर के चयापचय में भूमिका के साथ ही सेलुलर चयापचय में खेलता है. ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए कई तरीकों पहले से ही मौजूद हैं, लेकिन केवल कुछ ही मात्रात्मक हैं. हम यहाँ glucoamylase द्वारा ग्लूकोज में ग्लाइकोजन के विशिष्ट गिरावट पर आधारित है जो Abcam ग्लाइकोजन परख किट का उपयोग कर एक विधि का वर्णन. ग्लूकोज तो विशेष रूप से प्रतिदीप्ति निर्माण करने के लिए OxiRed जांच के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक उत्पाद ऑक्सीकरण हो जाता है. अनुमापन, सही संवेदनशील है और सेल के अर्क या ऊतक वर्गों पर प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, अन्य तकनीकों के विपरीत, यह सेल में ग्लाइकोजन के वितरण के बारे में जानकारी देना नहीं है. इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में, हम normoxia में incubated दो सेल लाइनों, चीनी हैम्स्टर फेफड़ों fibroblast CCL39 और मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा LS174, हाइपोक्सिया बनाम (21% ओ 2) (1% 2 हे) में यहां ग्लाइकोजन का अनुमापन का वर्णन. हम हाइपोक्सिया एक हस्ताक्षर है कि धारणाएनएएल कि कोशिकाओं 1 जीवित रहने के लिए synthesize और दुकान ग्लाइकोजन के लिए तैयार करता है.
Introduction
ग्लाइकोजन कई प्रकार की कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में मौजूद है जो ग्लूकोज अवशेषों का एक multibranched बहुलक, है. यह कोशिकाओं में ऊर्जा भंडारण के मुख्य रूपों में से एक है और ग्लूकोज चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. सबसे स्तनधारी कोशिकाओं के तेजी से चयापचय तनाव के दौरान ग्लाइकोलाइसिस और एटीपी उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए ग्लूकोज में अपमानित किया जा सकता है और दुकान ग्लाइकोजन, उत्पादन करने में सक्षम हैं. Hepatocytes जिससे शरीर को ग्लूकोज की एक सतत आपूर्ति प्रदान करने के लिए रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित करने के लिए ग्लाइकोजन का भारी मात्रा में उत्पादन. इसके विपरीत, अन्य कोशिकाओं (मांसपेशियों, लाल रक्त कोशिकाओं, आदि) में ग्लाइकोजन की एकाग्रता अपेक्षाकृत कम है. हालांकि, स्थानीय स्तर पर, इन मात्रा में कोशिकाओं अचानक पोषक तत्वों से वंचित एक वातावरण के संपर्क में हैं जब अल्पकालिक में ऊर्जा प्रदान करने के लिए पर्याप्त हैं.
ग्लाइकोजन संश्लेषण और ग्लाइकोजन टूटने सभी ऊतकों में एक ही कदम (चित्रा 1) इस प्रकार है. सबसे पहले, ग्लूकोजग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों (gluts) द्वारा कोशिकाओं में प्रवेश करती है, और तेजी से phosphoglucomutase द्वारा ग्लूकोज-1-फॉस्फेट (G1P) में ग्लूकोज 6 फॉस्फेट (G6P) से बदल जाती है. G1P तो यूडीपी ग्लूकोज में परिवर्तित हो जाता है, और यूडीपी ग्लूकोज की कार्बन सी 1 glycogenin, ग्लाइकोजन की एंकरिंग प्रोटीन की एक tyrosine अवशेषों से जुड़ा हुआ है. इस अणु, एक ग्लाइकोजन प्राइमर माना, ग्लाइकोजन synthase के माध्यम से एक α (1 → 4) बंधन से टर्मिनल ग्लूकोज को यूडीपी ग्लूकोज की कुर्की के लिए बढ़ा दी है. 11 से अधिक ग्लूकोज अवशेषों की एक रेखीय श्रृंखला बनाई है अंत में, जब शाखाओं में एंजाइम पास एक α (1 → 6) लिंकेज के माध्यम से श्रृंखला की एक और ग्लूकोज को 6 ग्लूकोज अवशेषों की एक न्यूनतम द्वारा गठित एक टर्मिनल oligosaccharide स्थानान्तरण. इस प्रक्रिया की पुनरावृत्ति बारी प्रति 6.5 ग्लूकोज के साथ एक हेलिक्स कि शाखाओं से युक्त एक विशाल भग्न संरचना देता है. ग्लाइकोजन ठोस कार्रवाई से ग्लूकोज के विपरीत hydrolyzed हो सकता हैएक शाखा के ग्लूकोज के अंतिम अवशेषों और ग्लाइकोजन अणु के बीच बाध्य glycosidic α (1 → 4) hydrolyzes कि α (1 → 6) ही है और ग्लाइकोजन phosphorylase hydrolyze एंजाइमों कि debranching की. Glycogenolysis नामक यह प्रतिक्रिया (एटीपी खपत को दर्शाती) एएमपी के स्तर में वृद्धि से सक्रिय है, और ग्लूकोज और एटीपी 2,3 से हिचकते हैं.
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा, ग्लाइकोजन अणुओं कई प्रकार की कोशिकाओं व्यास में 15-30 एनएम के रूप में β मुक्त कण (या ग्लाइकोजन monoparticles) में वर्णित किया गया है. ऐसे hepatocytes के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में, β कणों 80 एनएम से 200 एनएम 4 की एक अधिकतम करने के लिए व्यास में भिन्नता भी है कि α कणों के रूप में जाना जाता rosettes, फार्म करने के लिए एक परिसर में इकट्ठा किया जा सकता है 5, हाइड्रोजन संबंध, या यहां तक कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत से 6 से बंधुआ किया जा सकता है साबित करने के लिए जाता है. कोशिकाओं में संग्रहित ग्लाइकोजन की राशि कई मापदंडों पर निर्भर करता है: (मैं) ग्लाइकोजन संश्लेषण शुरू की है कि सेल में glycogenin की राशि, प्रोटीन phosphorylation / dephosphorylation द्वारा विनियमित ग्लाइकोजन synthase और phosphorylase (ii) गतिविधि, (iii) एकाग्रता ऐसे नाड़ी तंत्र से ग्लूकोज की आपूर्ति और कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज तेज के रूप में कई मापदंडों पर निर्भर है जो कोशिकाओं में ग्लूकोज की. ग्लाइकोजन भंडार कसकर ऊर्जा चयापचय को विनियमित हार्मोन द्वारा, मध्यवर्ती मेटाबोलाइट्स के माध्यम से biosynthetic हार्मोन की allosteric विनियमन द्वारा विनियमित, और पोषक तत्व संवेदन संकेत दे रास्ते 7 से कर रहे हैं.
यह होना ज़रूरी हैबेहतर पूरे शरीर और सेलुलर स्तर पर ग्लाइकोजन चयापचय के महत्व को समझने के लिए जैविक नमूने में ग्लाइकोजन यों के लिए सक्षम. हम यहाँ ग्लाइकोजन के लिए इन विट्रो परख में एक, सटीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुविधाजनक जैव रासायनिक वर्णन. इस तकनीक को ग्लाइकोजन के विशिष्ट हाइड्रोलिसिस पहले और बाद में मात्रा का ठहराव ग्लूकोज प्रतिदीप्ति पर आधारित है.
अन्य तरीकों कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के स्तर का अनुमान मौजूद हैं, लेकिन उनमें से ज्यादातर मात्रात्मक नहीं हैं. कोशिकाओं में ग्लाइकोजन की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित पहले तकनीकों में से एक ग्लाइकोजन 8,9 में [14 सी] ग्लूकोज समावेश के माप के आधार पर किया गया था. रेडियोधर्मिता का उपयोग संभाल करने के लिए इस प्रक्रिया को और अधिक कठिन बना देता है, लेकिन यह ग्लाइकोजन में और बाहरी शाखाओं पर और अणु के मूल में ग्लूकोज के अवशेष के वितरण के बीच भेद में ग्लूकोज समावेश की दर प्रदान करने का लाभ दिया है (यह भी एक आवश्यकता है अतिरिक्त β-amylolyबहन और एक chromatographic कदम). एक और तकनीक को और अधिक हाल ही में विकसित किया गया था और 2 NBDG के समावेश पर आधारित है (2 - {एन [7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-YL] अमीनो}-2-deoxyglucose), एक ग्लाइकोजन 10 में 2-deoxyglucose फ्लोरोसेंट व्युत्पन्न,. मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता का उत्पादन ग्लाइकोजन की मात्रा को दर्शाता है और एक प्रतिदीप्ति पाठक के साथ मापा जा सकता है. सेल में प्रतिदीप्ति का वितरण भी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
अन्य nonquantitative तकनीक के अलावा, आवधिक एसिड-Schiff धुंधला (पीए) शायद सबसे आम है. यह तय कोशिकाओं, आयल में ऊतक वर्गों या फ्रोजन में ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बैंगनी में इस ऊतकीय तकनीक रंगों गैर विशेष रूप से polysaccharides, glycolipids, ग्लाइकोप्रोटीन, सेल्यूलोज और तटस्थ mucins. इस परीक्षण की विशिष्टता विशेष रूप से ग्लाइकोजन हज़म जो डायस्टेज, साथ तय कोशिकाओं या ऊतक वर्गों के उपचार के द्वारा बढ़ाया जा सकता है. इसके बाद,ग्लाइकोजन के स्तर में गुणात्मक (कार्बोहाइड्रेट ग्लाइकोजन छोड़कर बड़े अणुओं संशोधित) हाइड्रोलाइज्ड नमूने के unhydrolyzed नमूने (सभी कार्बोहाइड्रेट संशोधित अणुओं) की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है. ग्लाइकोजन के जैव रासायनिक assays के विपरीत पीए धुंधला और सूक्ष्म विश्लेषण, दूर तक फैला हुआ या सेल के एक खास हिस्से में केंद्रित किया जा सकता है जो सेल में ग्लाइकोजन के वितरण के विषय में जानकारी प्रदान करता है. यहां तक कि विभिन्न स्थितियों के बीच ग्लाइकोजन संचय में पीए धुंधला अनुमानों मतभेद हालांकि, हालांकि, यह 11 मात्रात्मक नहीं है.
एक मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी मूल रूप से प्रतिजन विट्रो 12 में कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के साथ और शुद्ध ग्लाइकोजन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है के रूप में जबड़े वाहकनलिका उपास्थि का उपयोग किया. इस एंटीबॉडी विशेष रूप से ग्लाइकोजन से संबंधित चीनी श्रृंखला पहचानता है, यह पीए धुंधला की तुलना में एक अधिक विशिष्ट तरीके से immunohistochemistry द्वारा ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं और ग्लाइकोजन भंडारण की डिग्री के मूल्यांकन में ग्लाइकोजन के अनाज के दृश्य की अनुमति देता है कि एक और तकनीक है. वास्तव में, ग्लाइकोजन β कणों इलेक्ट्रान घने कणिकाओं 1 के रूप में एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से पहचानने योग्य होते हैं.
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Protocol
ग्लाइकोजन की बायोकेमिकल अनुमापन
1. सेल
- 100 मिमी व्यास पकवान प्रति 0.5-2 एक्स 10 6 के एक एकाग्रता में बीज कोशिकाओं.
- उपचार: कोशिकाओं सेते 24, 1% या 0.1% 2 हे, 94% या कम सेट एक बग बॉक्स अवायवीय काम स्टेशन (Ruskinn प्रौद्योगिकी BIOTRACE इंटरनेशनल पीएलसी, Bridgend, ब्रिटेन) में कम ऑक्सीजन एकाग्रता (हाइपोक्सिया) में 48, या 72 घंटे 94.9% एन 2, और 5% सीओ 2. समानांतर में, (21% 2 हे, 5% सीओ 2) normoxia में कोशिकाओं को सेते हैं. प्रयोग के समय के दौरान ग्लूकोज एकाग्रता में बदलाव को कम करने के लिए हर 24 घंटे (25 मिमी ग्लूकोज युक्त मध्यम) मध्यम बदलें.
- उपचार के बाद, धोने कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से ग्लूकोज के निशान को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 2x. ठंड पीबीएस में परिमार्जन कोशिकाओं.
- 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर समाधान अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और पीबीएस के साथ एक बार गोली धोने. गोली आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जा सकता है.
- आसुत जल के 100 μl में गोली Resuspend. ग्लाइकोजन परख किट (Abcam) के साथ प्रदान की ग्लाइकोजन हाइड्रोलिसिस बफर के 100 μl जोड़ें. एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर lysate उबाल लें.
- अघुलनशील उत्पादों को दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए 13,000 rpm पर भंवर और अपकेंद्रित्र lysate. सतह पर तैरनेवाला रखें.
- नमूनों के बीच प्रोटीन सामग्री को ग्लाइकोजन स्तर मानक के अनुसार, प्रोटीन की मात्रा का ठहराव Bicinchoninic एसिड परख (बीसीए-Interchim) का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला के 25-35 μl के साथ किया जा सकता है.
Lysate के कुछ कोशिकाओं के अंदर मुक्त ग्लूकोज एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. ग्लाइकोजन की hydrolysis
- हाइड्रोलिसिस एनजाइम मिक्स के 1 μl के साथ सतह पर तैरनेवाला (चरण 1) के 50 μl मिलाएं. इस मिश्रण glucoamylase होता है. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- मानक ग्लाइकोजन गिराए अंशांकन वक्र तैयार (2 मिलीग्राम / एमएल) कीहाइड्रोलिसिस बफर में 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक समाधान के लिए किट के साथ upplied. इसके बाद, छह अलग 0 के साथ ट्यूब, 4, 8, 12, 16, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल मानक के 20 μl तैयार करने और 0 से ग्लाइकोजन की एकाग्रता देने के लिए हाइड्रोलिसिस बफर के साथ 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए प्रत्येक ट्यूब समायोजित 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, और 0.2 ग्राम / एमएल. मानकों में हाइड्रोलिसिस एनजाइम मिक्स के 1 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
मुफ्त ग्लूकोज एकाग्रता के लिए मूल्य द्वारा दिए गए सेल लाइन की पृष्ठभूमि ग्लूकोज एकाग्रता, सेल में ग्लाइकोजन के स्तर को निर्धारित करने के लिए कुल ग्लूकोज एकाग्रता (ग्लाइकोजन हाइड्रोलिसिस + मुक्त ग्लूकोज से ग्लूकोज) के लिए मूल्य से घटाया जाना चाहिए.
3. विकास और प्रतिदीप्ति का पठन
- हर हालत के लिए, मुफ्त ग्लूकोज एकाग्रता और दो ट्यूबों को मापने के लिए (ट्यूब 1) एक ट्यूब तैयार (ट्यूब 2 और 3) कुल ग्लूकोज एकाग्रता (प्रत्येक ट्यूब बुद्धि को मापने के लिएहाइड्रोलाइज्ड ग्लाइकोजन की हा अलग मात्रा).
- ट्यूब 1 में चरण 1 के अंत में निकाले सतह पर तैरनेवाला के 15 μl जोड़ें. 50 μl के अंतिम मात्रा को पूरा करने के लिए हाइड्रोलिसिस बफर के 35 μl जोड़ें. प्राप्त प्रतिदीप्ति मुक्त ग्लूकोज एकाग्रता दे देंगे.
- ट्यूब 2 में (चरण 2 में प्राप्त) हाइड्रोलाइज्ड ग्लाइकोजन की एक्स μl जोड़ें. 50 μl के अंतिम मात्रा को समायोजित करें. नमूना मात्रा (एक्स μl) अंशांकन वक्र की सांद्रता से परे नहीं हैं कि प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्राप्त करने के क्रम में सेल घनत्व और / या सेल प्रकार के अनुसार समायोजित किया जाना है.
- ट्यूब 3 में hydrolyzed ग्लाइकोजन के 2 एक्स μl जोड़ें. 50 μl के अंतिम मात्रा को समायोजित करें.
- प्रत्येक ट्यूब के लिए विकास बफर के 48.7 μl, विकास एनजाइम मिक्स के 1 μl और (ग्लाइकोजन परख किट में आपूर्ति) OxiRed जांच के 0.3 μl मिश्रण से नमूने और मानकों के लिए एक विकास समाधान तैयार करें. उदाहरण के लिए, 2 की स्थिति के लिए, 12 ट्यूब के लिए एक मिश्रण तैयारएस (मानकों के लिए 6, मुक्त ग्लूकोज के लिए 2 और कुल ग्लूकोज प्रतिदीप्ति के लिए 4).
- प्रत्येक ट्यूब करने के लिए इस मिश्रण की 50 μl जोड़ें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- सिफारिश के रूप में 535 एनएम, 587 एनएम के एक तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति, और उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए 3 एनएम के एक भट्ठा उपाय.
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Representative Results
ट्यूमर कोशिकाओं को ट्यूमर संकेतों में ऑक्सीजन (हाइपोक्सिया) जीवित रहने के लिए, ताकि बाद में पोषक तत्व कमी को संभालने के लिए ऊर्जा की दुकान की जरूरत के एक निम्न स्तर. ग्लाइकोजन स्तनधारी कोशिकाओं में ग्लूकोज का मुख्य ऊर्जावान बहुलक है के रूप में, हम हाइपोक्सिया में ग्लाइकोजन भंडारण के नियमन का अध्ययन किया. टेबल्स 1, 2, और 3 के रूप में दिखाया सेल lysates में ग्लाइकोजन की एकाग्रता की गणना और मानकीकरण प्रतिदीप्ति के कच्चे डेटा पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. ग्लाइकोजन के लिए जैव रासायनिक परख इलेक्ट्रॉन घने समुच्चय (2A चित्रा) (चित्रा 2 बी) के कणों glycogen गया CCL39 कोशिकाओं की इलेक्ट्रॉन micrographs पर मनाया पुष्टि की. हाइपोक्सिया में ग्लाइकोजन के संचय प्रतिलेखन कारक hypoxia-inducible कारक -1 (HIF-1) (चित्रा 3), हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर अनुकूलन में शामिल प्रमुख प्रतिलेखन कारक पर निर्भर है. अंत में, हम विभिन्न कैंसर में प्रदर्शन औरसंग्रहीत ग्लाइकोजन तेजी से कम से कम 6 घंटे (चित्रा -4 ए) में सेल द्वारा metabolized, और ग्लाइकोजन का उपयोग ग्लूकोज भुखमरी की शर्तों (चित्रा 4 बी) के तहत सेल मौत के खिलाफ की रक्षा करता है कि हो सकता है कि noncancer सेल लाइनों 1.
तालिका 1.
| ग्लू. (माइक्रोग्राम) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| कच्चे डेटा प्रतिदीप्ति (RDF) | Fluo. | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - पृष्ठभूमि (मानक वक्र में 0 ग्राम के लिए प्रतिदीप्ति) | सुधार | 0 | <मजबूत> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| कच्चे डेटा Fluo. (RDF) | RDF - पृष्ठभूमि | (* 1000 सुधार) / ढलान मानक वक्र | ग्लाइकोजन टाइट्रेट करने के लिए इस्तेमाल नमूने की मात्रा | कच्चे डेटा प्रोटीन ध्यान केंद्रित-tration | γ * मात्रा नमूना | ग्लूकोज (एनजी) / प्रोटीन कुल | |
| कुल ग्लूकोज एकाग्रता 1 | Fluo. | सुधार | ग्लूकोज (एनजी) | मात्रा नमूना | | प्रोटीन कुल | ग्लूकोज (एनजी / ग्राम पीआर.) | |
| नमूना 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| नमूना 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| नमूना 3 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 1) | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0.88 | 240.3 |
तालिका 1.5.
| नमूना 4 (सीसीएल 39 सेमी 48h 2) | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| नमूना 5 (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 1) | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429.1 |
| 6 नमूना (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 2) | 174.7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430.9 |
| कच्चे डेटा Fluo. (RDF) | RDF - पृष्ठभूमि | (* 1000 सुधार) / ढलान मानक वक्र | ग्लाइकोजन टाइट्रेट करने के लिए इस्तेमाल नमूने की मात्रा | कच्चे डेटा प्रोटीन ध्यान केंद्रित-tration | γ * मात्रा नमूना | ग्लूकोज (एनजी) / प्रोटीनसंपूर्ण | |
| कुल ग्लूकोज एकाग्रता 2 | Fluo. | सुधार | ग्लूकोज (एनजी) | मात्रा नमूना | γ (माइक्रोग्राम / μl) | प्रोटीन कुल | ग्लूकोज (एनजी / ग्राम पीआर.) |
| नमूना 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| नमूना 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| नमूना 3 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 1) | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252.4 |
| नमूना 4 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| नमूना 5 (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 1) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412.3 |
| 6 नमूना (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 2) | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
तालिका 2.
| मुफ्त ग्लूकोज | Fluo. | सुधारने मोर्चे | ग्लूकोज (एनजी) | मात्रा नमूना | γ (माइक्रोग्राम / μl) | प्रोटीन कुल | ग्लूकोज (एनजी / ग्राम पीआर.) | नकारात्मक मान 0 के रूप में माना जाता है |
| नमूना 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| नमूना 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| नमूना 3 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 1) | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| नमूना 4 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| नमूना 5 (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 1) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| 6 नमूना (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
तालिका 3.
| कुल ग्लूकोज ध्यान केंद्रित-tration 1 | कुल ग्लूकोज ध्यान केंद्रित-tration 2 | कुल ग्लूकोज ध्यान केंद्रित-tration औसत | मुफ्त ग्लूकोज ध्यान केंद्रित-tration | ग्लाइकोजन (एनजी / ग्राम पीआर.) (कुल औसत ग्लूकोज - मुक्त ग्लूकोज) | (DUPLI-मोहनभोग के बीच) औसत ग्लाइकोजन | स्टेन-दर्द त्रुटि | |
| नमूना 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| नमूना 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| नमूना 3 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 1) | 240.3 | 252.4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| सैममिसाल 4 (सीसीएल 39 सेमी 48 घंटा 2) | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| नमूना 5 (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 1) | 429.1 | 412.3 | 420.7 | 0.0 | 420.7 | 426.6 | 8.4 |
| 6 नमूना (सीसीएल 39 सेमी 72 घंटा 2) | 430.9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
टेबल्स 1, 2, 3. प्रतिनिधि गणना और प्रतिदीप्ति पंक्ति datas से CCL39 कोशिकाओं की ग्लाइकोजन सामग्री को सामान्य बनाने. ग्लाइकोजन 48 घंटा या 72 घंटे के लिए 1% 2 हे (HX) normoxia (NX) में या हाइपोक्सिया में ऊष्मायन के बाद CCL39 में titrated किया गया था. ग्लाइकोजन माप हर हालत के लिए दो प्रतियों में किया गया है. के शीर्ष भाग
चित्रा 1. ग्लाइकोजन चयापचय:. ग्लाइकोजन संश्लेषण और गिरावट का अवलोकन ग्लूकोज hexokinases 1 और 2 (एच) द्वारा ग्लूकोज 6 फॉस्फेट में परिवर्तन के लिए ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों (gluts) के माध्यम से सेल cytoplasm में प्रवेश करती है. ग्लूकोज 6 फॉस्फेट (G6P) ग्लाइकोलाइसिस, pentose फॉस्फेट मार्ग और ग्लाइकोजेनिसस के बीच जंक्शन पर है. Phosphoglucomutase (PGM) हैफिर ग्लूकोज-1-फॉस्फेट urydylyltransferase (UGP) द्वारा यूडीपी ग्लूकोज में बदल जाता है, जो ग्लूकोज 1-फॉस्फेट (G1P), में G6P के रूपांतरण catalyzes कि ग्लाइकोजेनिसस में पहली एंजाइम. यूडीपी ग्लूकोज glycogenin की गठित एक एंकोरेज अणु और एक शाखाओं में बंटी एंजाइम (इ) से जुड़ी एक ग्लूकोज अवशेषों बढ़ाना ग्लाइकोजन synthase (जी एस) द्वारा किया जाता है. ग्लाइकोजन synthase और शाखाओं में एंजाइमों भी ग्लाइकोजेनिसस कहा जाता है, ग्लाइकोजन के गठन में सहयोग करें. ग्लाइकोजन phosphorylase (जीपी) और debranching एंजाइमों (DBE) के माध्यम से G1P में ग्लाइकोजन hydrolyzes कि रिवर्स प्रक्रिया glycogenolysis कहा जाता है. 3 से अनुकूलित.
चित्रा 2. गैर कैंसर कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया में ग्लाइकोजन का संचय. (ए) normoxia में CCL39 की इलेक्ट्रॉन micrografts (NX) (बाएं पैनल) और हाइपोक्सिया 1% 2 हे (HX 1%60, 96 घंटा) (सही पैनल). तीर ग्लाइकोजन कणों का समुच्चय निरूपित. CCL39 में ग्लाइकोजन की राशि (काली सलाखों) और एक 25 में 48, 72, और 96 घंटे के लिए normoxia (NX) या हाइपोक्सिया 1% 2 हे (HX 1%) में उगाई LS174 (सफेद सलाखों सेल) (बी) Quantitation मिमी ग्लूकोज युक्त मध्यम.
चित्रा 3. हाइपोक्सिया में ग्लाइकोजन के संचय LS174 pTerHIF-1α में ग्लाइकोजन राशि के HIF-1. मात्रा पर निर्भर है. इन कोशिकाओं को टेट्रासाइक्लिन की हालत में HIF-1α के खिलाफ एक shRNA व्यक्त inducible क्लोन कर रहे हैं. टेट्रासाइक्लिन (TET) के या उपस्थिति (+) - () अनुपस्थिति में - सेल (NX) (सफेद सलाखों) या हाइपोक्सिया 0.1% 2 हे (काली सलाखों Hx 0.1%) normoxia में वृद्धि हुई.
चित्रा 4. ग्लाइकोजन Storaजीई कोशिका मृत्यु से बचाता है. (ए), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF 7 (●), और एमडीए MB231 (एक्स) कोशिकाओं 96 घंटे के लिए 1% 2 हे हाइपोक्सिया के अधीन और 6 के लिए ग्लूकोज मुक्त माध्यम में फिर सुसंस्कृत थे घंटा. ग्लाइकोजन एकाग्रता सिर्फ ग्लूकोज को हटाने से पहले मापा और 100% का प्रतिनिधित्व करता था. ग्लाइकोजन तो 1, 3 पर मापा, और 6 घंटा की गई थी. परिणाम कम से कम तीन अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. CCL39 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का (बी) के मापन. 96 घंटे के लिए या हाइपोक्सिया (+ भंडारण) और कोशिका मृत्यु को मापने से पहले 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया में ग्लूकोज मुक्त माध्यम में incubated - (भंडारण) कक्ष normoxia या तो के अधीन थे.
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Discussion
इन विट्रो में ग्लाइकोजन की बायोकेमिकल अनुमापन कोशिकाओं ग्लाइकोजन सामग्री का सही मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. कुछ अन्य तकनीकों (एक ग्लाइकोजन एंटीबॉडी के साथ पीए, immunofluorescence, आदि.) के मुकाबले इस अनुमापन बहुत, विशेष रूप से संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. यह कोई रेडियोसक्रियता लेकिन एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर की आवश्यकता है क्योंकि इसके अलावा, विधि सुविधाजनक है. हालांकि, इस तकनीक को विशुद्ध रूप से मात्रात्मक है और सेल में ग्लाइकोजन वितरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है.
इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक सेल निष्कर्षों पर हासिल की है लेकिन यह भी ऊतकों से ग्लाइकोजन की निकासी के लिए एक उचित विधि के साथ ऊतक वर्गों पर प्राप्त किया जा सकता है. इस परख में इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है और कारण ग्लाइकोजन के एक अप्रत्यक्ष माप के लिए (ग्लूकोज में हाइड्रोलिसिस के बाद), यह vivo में ग्लाइकोजन भंडार का पालन करने के लिए विकसित नहीं किया जा सकता.
पीए धुंधला व्यापक रूप से पहले से ही हैकई ग्लाइकोजन भंडारण रोगों (वॉन Gierke रोग, कोरी रोग, मैकअर्ड्ल रोग, आदि) का निदान किया. यह भी फंगल संक्रमण का पता लगाने के लिए या ट्यूमर के विभिन्न उपप्रकार के बीच भेदभाव किया जाता है. सिद्धांत रूप में, पीए धुंधला ग्लाइकोजन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषक के लिए युग्मित किया जा सकता है. अभ्यास में, इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है और निम्न कारणों से यहाँ वर्णित विधि से भी कम समय उपयुक्त है. पीए सकारात्मक धुंधला (बैंगनी) नकारात्मक धुंधला (Hematoxylin नीला) के साथ overlaps के रूप में सबसे पहले, यह सकारात्मक संकेत हटाने के बिना नकारात्मक संकेत बाहर करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन है. रंग की तीव्रता रंगाई, कपड़े धोने, आदि का निर्धारण, प्रभावकारिता के समय पर निर्भर कर सकता है, क्योंकि इसके अलावा, पीए धुंधला हो जाना, ग्लाइकोजन यों के लिए काफी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है. पीए धुंधला पर केंद्रित है, जबकि अंत में, इस जैव रासायनिक पद्धति, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए ग्लाइकोजन के एक औसत एकाग्रता देता है इसलिए एक विशिष्ट क्षेत्र और समग्र ग्लाइकोजन एकाग्रता की कम प्रतिनिधि है.
ग्लाइकोजन के जैव रासायनिक परख ऊतक में ग्लाइकोजन के स्तर पर बहुत ही सटीक और जानकारीपूर्ण डेटा प्रदान कर सके. इन आंकड़ों उदाहरण के लिए परिकल्पित रूप रोग प्रगति के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है, या ग्लाइकोजन चयापचय पर उपचार के प्रभाव को समझने में मदद कर सकते हैं. दूसरी ओर, इस तकनीक को कई कदम (प्रोटीन quantitation, ग्लाइकोजन की hydrolysis और नमूना प्रति तीन प्रतिदीप्ति रीडिंग की एक न्यूनतम) की आवश्यकता है, और पीए धुंधला से कम व्यावहारिक लगता है. शारीरिक या pathophysiological चयापचय (कैंसर, आदि.) की एक बेहतर समझ के लिए, यह ठीक ग्लाइकोजन द्वारा प्रदान ग्लूकोज (और एटीपी) यों के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, अकेले ग्लाइकोजन मात्रा का ठहराव ग्लाइकोजन चयापचय को समझने के लिए पर्याप्त नहीं है और कोशिकाओं में ग्लाइकोजन का वितरण निर्धारित करने के लिए माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर किया जाना चाहिए.
NT "> यह इस परख की सटीकता और reproducibility के बावजूद, प्रोटीन सामग्री में एक छोटा सा बदलाव ग्लाइकोजन की सामान्यीकृत मूल्यों के बड़े बदलाव का कारण बन सकता है बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति में एक रेखीय वृद्धि के साथ है, हालांकि वहां ग्लाइकोजन एकाग्रता, linearity संकेत नाटकीय बूँदें जिसके लिए उच्च एकाग्रता पर नहीं रखा जाता. इस प्रकार, हम खाते में अंशांकन वक्र की सांद्रता परे प्रतिदीप्ति मूल्यों लेने के लिए नहीं की सलाह देते हैं. इसलिए हम दो अलग नमूना संस्करणों के साथ दो रीडिंग प्रदर्शन सलाह देते हैं. में इस तरह से प्रतिदीप्ति कोशिकाओं में ग्लाइकोजन को दर्शाता है और प्रतिदीप्ति में एक कमी की भरपाई नहीं कर रहा है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
हम हमें प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने की अनुमति के लिए और उनकी मदद के लिए डॉ. थियरी Pourcher के लिए आभारी हैं. प्रयोगशाला लीग नेशनल Contre ले कैंसर (Equipe labellisée) द्वारा वित्त पोषित है, एसोसिएशन ला Recherche contre Le कैंसर, Institut राष्ट्रीय du कैंसर (इंका) बहना, एजेंस नेशनल ला Recherche, METOXIA (ईयू कार्यक्रम FP7), केंद्र डालना ए Lacassagne, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique, Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale और अच्छा विश्वविद्यालय ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). हम महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादकीय सुधार के लिए डॉ. एम क्रिस्टियन Brahimi हॉर्न धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
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