Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em> Arabidopsis thaliana</em> Schorsing Celkweken
Summary
Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.
Abstract
Plasmamembraan microdomeinen zijn functies op basis van de fysische eigenschappen van het lipide en sterol milieu en hebben een specifieke rol bij het signaleren van processen. Extraheren-sterol verrijkte membraan microdomeinen van plantencellen voor proteomics analyse is een moeilijke taak vooral te wijten aan meerdere voorbereidende stappen en de bronnen van verontreinigingen uit andere cellulaire compartimenten. Het plasmamembraan vormt slechts 5-20% van de membranen in een plantencel, en dus isolatie van sterk gezuiverde celmembraan fractie uitdagend. Een veel gebruikte methode bestaat waterige twee-fase verdeling in polyethyleenglycol en dextran, die plasmamembraan vesicles oplevert met een zuiverheid van 95% 1. Sterol-rijke membraan microdomeinen binnen het plasmamembraan onoplosbaar na behandeling met koud ionogene detergentia bij alkalische pH. Dit detergent-resistente membraan fractie kan vanuit de bulk plasmamembraan worden gescheiden door ultracentrifuge in alsucrose gradiënt 2. Vervolgens kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit de lage dichtheid band van de sucrose gradiënt van methanol / chloroform precipitatie. Geëxtraheerd eiwit vervolgens met trypsine worden gedigereerd, ontzout en tenslotte geanalyseerd met LC-MS/MS. De extractie protocol voor sterol-rijke microdomeinen is geoptimaliseerd voor de bereiding van schone detergens resistent membraan fracties uit Arabidopsis thaliana celkweken.
We gebruiken volledige metabole kenmerken van Arabidopsis thaliana schorsing celculturen met K 15 NO 3 als de enige bron van stikstof voor kwantitatieve vergelijkende proteomics studies na biologische behandeling van belang 3. Door gelijke verhoudingen van gelabelde en ongelabelde celculturen gezamenlijke eiwitextractie invloed voorbereiding stappen uiteindelijke kwantitatief resultaat wordt minimaal gehouden. Ook verlies van materiaal tijdens de extractie zowel controle en behandeling monsters op dezelfde wijze affectd dus de verhouding van licht en bijdraaien peptide blijft constant. In de voorgestelde werkwijze ofwel gemerkt of ongemerkt celkweek ondergaat een biologische behandeling, terwijl de andere dient als controle 4.
Introduction
In 1972, Jonathan Singer en Garth Nicolson voorgesteld de vloeistof mozaïek model een structuur model van cellulaire membranen, het vervangen van de eiwit-lipide-eiwit sandwich model dat in het algemeen in de vroege jaren 1960 werd aanvaard. Singer en Nicolson gepostuleerd dat het biologische membraan kan worden beschouwd als een tweedimensionale vloeistof waar alle lipiden en eiwitmoleculen vrij en gemakkelijk 5 diffunderen. Sindsdien structuurmodel van het plasmamembraan en kennis van het membraan preparaat werd nog ingewikkelder. Vooral in de plasmamembraan, structuren zoals eiwitcomplexen lipiden / sterol gebaseerd structureel verstoord microdomeinen worden waargenomen. In kunstmatige modelmembranen 6,7, kan sterolen en sphingolipiden zijdelings te scheiden van andere soorten lipiden aan regio's te vormen met gewijzigde fysieke kenmerken. Deze segregatie binnen het celmembraan wordt voornamelijk veroorzaakt door de zelfassocierende eigenschappen tussen sterolen en zeer saonverzadigde koolwaterstof ketens van phopsho-en sfingolipiden 8. Bijzonder, de starre sterol ringen gunst interacties met stijvere en rechtere verzadigde soorten lipiden en deze interacties dwingen naburige koolwaterstofketens in meer uitgebreide conformaties, toenemende membraandikte en hardheid.
Een van de vaak waargenomen kenmerken sterol verrijkte membraan microdomeinen was hun onoplosbaarheid na behandeling met niet-ionische detergentia zoals Triton X-100 en Brij 35. Deze fracties werden verondersteld identiek met membraan microdomeinen te zijn en werden genoemd reinigingsmiddelenbestendige membranen (DRM) op basis van hun biochemische bereidingswijze 2. Het gebruik van niet-ionische detergenten tijdens DRM extractie kreeg kritiek omdat de biochemische DRM preparaat kan niet rechtstreeks overeen met een specifieke membraancompartiment binnen de levende cel 9. Vooral, het wasmiddel aan eiwitverhouding lijkt cruciaal in dergelijke preparaten, eenTussen verschillende detergenten, evenals verschillende hoeveelheden detergens kunnen andere samenstelling van de reinigingsmiddelenbestendige membraanfractie 10 opleveren. Er is bewijs dat bepaalde proteïne species specifiek associëren met deze cellulaire sterol-rijke membraan domeinen, en dat deze eiwitten zijn goed verrijkt biochemische preparaten wasmiddel-resistente membraan fracties 11. De kern van eiwitten die werden gevonden in plantaardige DRM fractie en waarbij de aanwezigheid DRM was sterol afhankelijk waren bijzonder GPI-verankerde eiwitten, zoals fascicline-achtige eiwitten arabinogalactaan (knip) en leden van de SKU eiwitfamilie. Ook enkele signalerende proteïnen, zoals receptor-achtige kinasen of fosfolipase gevonden 11. Deze resultaten zijn consistent met vele proteomische studies voor zoogdieren membraan microdomeinen 12,13. Ook in planten is er steeds meer bewijs voor de rol van membraan microdomeinen in context van stress respons 14 –16.
De hier beschreven protocol voorziet in een robuuste methode voor fractionering van plasmamembraan microdomeinen en bijzonder maakt gebruik van een eiwit aan detergent concentratie die ons in staat stelt om stress geïnduceerde veranderingen van de sterol-rijke membraancompartiment 4,11,14 verbeelden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit document protocol bevat vele stappen en ze zijn cruciaal voor zuivere en representatieve fractionering van de plant plasmamembraan in reinigingsmiddelenbestendige membranen en detergent oplosbare fracties te verkrijgen. Daarom is het belangrijk om elke stap te volgen instructies.
Behandeling van de plasmamembraan fractie met niet-ionisch detergens (stap 3.2) heeft de sterkste invloed op de kwaliteit van het membraan microdomain fractionering. Om reproduceerbare resultaten te verkri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
