Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em> Arabidopsis thaliana</em> Cultures Suspension cellulaires
Summary
Ici, nous décrivons une méthode robuste pour le fractionnement des membranes plasmiques de plantes en détergents solubles dans les membranes résistantes et de détergent à base d'un mélange de non marqué et in vivo entièrement 15 N étiquetés cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana. La procédure est appliquée pour des études comparatives de la protéomique pour comprendre les processus de signalisation.
Abstract
Plasma microdomaines membranaires sont des caractéristiques basées sur les propriétés physiques de l'environnement des lipides et des stérols et ont des rôles particuliers dans les processus de signalisation. Extraction microdomaines enrichis en stérols à partir de cellules végétales pour l'analyse protéomique est une tâche difficile principalement en raison de multiples étapes de préparation et sources de contaminations d'autres compartiments cellulaires. La membrane plasmique constitue seulement environ 5 à 20% de l'ensemble des membranes dans une cellule végétale, et par conséquent, l'isolement de la fraction de membrane plasmatique hautement purifié est difficile. Une méthode fréquemment utilisée consiste partitionnement aqueuse à deux phases dans le polyéthylène glycol et le dextrane, qui produit des vésicules de membrane de plasma avec une pureté de 95% 1. Microdomaines membranaires riches en stérols au sein de la membrane plasmique sont insolubles lors d'un traitement avec des détergents non ioniques à froid à un pH alcalin. Cette fraction de membrane résistant aux détergents peut être séparée de la membrane plasmique en vrac par ultracentrifugation en tant quegradient ucrose 2. Par la suite, les protéines peuvent être extraites de la bande de basse densité du gradient de saccharose par un mélange méthanol / chloroforme précipitation. Protéine extraite est ensuite digéré la trypsine, dessalée et enfin analysé par LC-MS/MS. Notre protocole d'extraction de microdomaines riches en stérols est optimisée pour la préparation de fractions membranaires de nettoyage détergentes résistant à partir de cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana.
Nous utilisons marquage métabolique complète des cultures de cellules en suspension d'Arabidopsis thaliana avec K 15 NO 3 en tant que seule source d'azote pour les études protéomiques comparatives quantitatives suivantes de traitement biologique d'intérêt 3. Par les rapports de mélange égaux de cultures de cellules marquées et non marquées pour l'extraction des protéines de l'influence conjointe d'étapes de préparation de résultat quantitatif finale est maintenue à un minimum. De plus la perte de matière lors de l'extraction affecte à la fois le contrôle et le traitement des échantillons de la même manière, und donc le rapport de la lumière et le pilonnement peptide restera constante. Dans la méthode proposée soit marqué ou non marqué culture de cellules est soumis à un traitement biologique, tandis que l'autre sert de contrôle 4.
Introduction
En 1972, Jonathan Singer et Garth Nicolson proposé le modèle de la mosaïque fluide un modèle de la structure des membranes cellulaires, en remplaçant le modèle sandwich protéine-lipide-protéine qui a été généralement acceptée dans les années 1960. Singer et Nicolson ont postulé que la membrane biologique peut être considérée comme un liquide à deux dimensions où toutes les molécules de lipides et de protéines diffusent librement et facilement 5. Depuis ce temps, le modèle de la structure de la membrane plasmique et la connaissance de la composition de la membrane devient encore plus complexe. En particulier, au sein de la membrane plasmique, tels que des structures complexes de protéines et de troubles à base structurellement microdomaines lipidiques / stérol peuvent être observées. Dans les membranes des modèles artificiels 6,7, stérols et sphingolipides peuvent latéralement séparer des autres espèces lipidiques pour former des régions avec des caractéristiques physiques altérées. Cette ségrégation au sein de la membrane cellulaire est principalement causée par les propriétés d'auto-associer entre stérols et hautement sachaînes hydrocarbonées turés de phopsho-et sphingolipides 8. En particulier, les anneaux de stérol rigides favorisent les interactions avec les espèces plus rigide et rectiligne de lipides saturés et forcent ces interactions des chaînes hydrocarbonées voisins dans plusieurs conformations étendues, ce qui augmente l'épaisseur de la membrane et de la dureté.
L'une des fonctions les plus couramment observées de stérol enrichi microdomaines membranaires est leur insolubilité lors d'un traitement avec des détergents non ioniques tels un Triton X-100 ou le Brij 35. Ces fractions ont été pensés pour être identique à microdomaines membranaires et ont été appelés membranes résistantes aux détergents (DRM) en fonction de leur méthode de préparation biochimique 2. L'utilisation de détergents non ioniques lors de l'extraction de DRM a reçu quelques critiques comme la préparation de DRM biochimique peut ne pas correspondre directement à un compartiment membranaire spécifique au sein de la cellule vivante 9. En particulier, le détergent à taux de protéine semble crucial dans ces préparations, unes des détergents différents, ainsi que différentes quantités de détergents peuvent produire une composition différente du détergent résistant fraction de membrane 10. Cependant, il est évident que certaines espèces de protéines s'associent spécifiquement avec ces domaines membranaires riches en stérols cellulaires, et que ces protéines sont bien enrichies en préparations biochimiques des fractions de membrane résistant aux détergents 11. Le noyau de protéines qui ont été trouvés dans la fraction de DRM de l'usine, et pour qui la présence dans les DRM était stérol charge, étaient en particulier des protéines GPI, telles que les protéines de fascicline comme arabinogalactanes (SADF) et des membres de la famille des protéines SKU. En outre, certaines protéines de signalisation, telles que les kinases ou phospholipases récepteurs ont été récupérées 11. Ces résultats sont compatibles avec de nombreuses études protéomiques sur microdomaines membranaires de mammifères 12,13. Également dans les plantes il est de plus en évidence le rôle des microdomaines membranaires dans le contexte de la réponse au stress 14 –16.
Le protocole décrit ici fournit une méthode robuste pour le fractionnement de plasma microdomaines membranaires et en particulier utilise une protéine de concentration de détergent qui nous permet de représenter le stress induit des altérations de la riche en stérols compartiment membranaire 4,11,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté dans ce document comporte de nombreuses étapes et chacun d'eux est crucial pour obtenir un fractionnement pur et représentatif de la membrane plasmique de la plante dans les membranes résistantes des détergents et des fractions solubles dans des détergents. Par conséquent, il est important de suivre chaque étape les instructions.
Le traitement de la fraction de membrane plasmatique avec un détergent non-ionique (étape 3.2) a la plus forte influence sur la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
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