比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em>シロイヌナズナ</em>サスペンション細胞培養
Summary
ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。
Abstract
原形質膜マイクロドメインは、脂質やステロール環境の物理的性質に基づいて特徴であり、プロセスのシグナル伝達に特定の役割を持っている。プロテオーム解析のための植物細胞からのステロールに富む膜マイクロドメインを抽出し、他の細胞区画からの汚染のために複数の準備手順とソースに主に困難な作業です。原形質膜は、植物細胞内のすべての膜の約5〜20％を構成し、従って、高度に精製された原形質膜画分の単離は困難である。頻繁に使用される方法は、95％の純度を有する1原形質膜小胞を生じるポリエチレングリコールおよびデキストラン中水性二相分配を伴う。原形質膜内のステロールに富む膜マイクロドメインは、アルカリ性pHで冷非イオン性界面活性剤での処置の際に不溶性である。この界面活性剤耐性膜画分は、で超遠心分離によりバルクプラズマ膜から分離することができるucroseグラデーション2。続いて、タンパク質は、メタノール/クロロホルム沈殿によってショ糖勾配密度の低いバンドから抽出することができる。抽出したタンパク質は、その後、脱塩し、最終的に、LC-MS/MSで分析トリプシン消化されます。ステロールに富むミクロドメインのための私達の抽出プロトコルは、 シロイヌナズナ細胞培養物からの清浄な界面活性剤耐性膜画分の調製のために最適化される。
我々は興味3の生物学的処理を以下の定量的な比較プロテオミクス研究のための唯一の窒素源としてK 15 NO 3とシロイヌナズナ懸濁細胞培養の完全な代謝標識を使用しています。関節タンパク質抽出のための標識および非標識細胞培養物の等量比を混合することにより、最終的な定量的結果についての準備段階の影響を最小限に維持される。また抽出時の材料の喪失は、コントロールと同じように処理サンプルの両方に影響を与えるDそのため、光とヒーブペプチドの比率は一定のままである。もう一方は対照4として機能する提案方法のいずれかで標識するか、または非標識の細胞培養は、生物学的処理を受ける。
Introduction
1972年には、ジョナサン·シンガーとガースニコルソンは、一般的に1960年代初頭に受理されたタンパク質 – 脂質 – タンパク質サンドイッチモデルを置き換え、流動モザイクモデルの細胞膜の構造モデルを提案した。歌手とニコルソンは生体膜は、すべての脂質およびタンパク質の分子が自由に拡散し、容易に5二次元液体として考えることができると仮定した。その時以来、膜組成の原形質膜と知識の構造モデルがさらに複雑になった。特に、原形質膜内に、そのようなタンパク質複合体および脂質/ステロール基づいて構造的に無秩序なミクロドメインのような構造を観察することができる。人工モデル膜6,7において、ステロールおよびスフィンゴ脂質は、横方向に変化した物理的特徴を有する領域を形成するために、他の脂質種から分離することができる。細胞膜内でのこの分離は、主にステロールの高いSA間の自己会合特性によって引き起こされるphopshoとスフィンゴ脂質8の炭化水素鎖をturated。特に、剛性ステロールリングは、剛性がまっすぐ飽和脂質種との相互作用に有利とこれらの相互作用は、膜の厚さ及び硬度を高める、より拡張された立体配座に隣接する炭化水素鎖を強制。
ステロール濃縮膜マイクロドメインの一般的に観察特徴の一つは、非イオン性界面活性剤、トリトンX-100またはブリジ35で処理するとそれらの不溶性だった。これらの画分を膜マイクロドメインと同一であると考えられていたし、その生化学的製造法2に基づいて、洗剤耐性膜（DRM）と呼ばれていました。 DRM抽出中の非イオン性界面活性剤の使用は、生化学的なDRMの準備を直接生きた細胞9内の任意の特定の膜コンパートメントに対応しないことなど、いくつかの批判を受けた。特に、タンパク質の比洗剤は、このような調製において重要と思われる異なる界面活性剤だ、ならびに異なる界面活性剤の量は、界面活性剤耐性膜画分10の異なる組成物を得ることができる。しかし、特定のタンパク質種は、これらの特異的細胞性ステロールに富む膜ドメインに関連付けることを示す証拠があり、これらのタンパク質がよく界面活性剤耐性膜画分11の生化学的調製物において富化される。植物DRM画分に認められた、とのDRMでの存在が依存ステロールであったために、タンパク質のコアは、このようなファスシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（のFLA）とのSKUタンパク質ファミリーのメンバーとして特にGPIアンカー型タンパク質であった。また、このような受容体様キナーゼまたはホスホリパーゼのようないくつかのシグナル伝達タンパク質は、11を発見された。これらの結果は、哺乳類の膜マイクロドメイン12,13に関する多くのプロテオミクス研究と一致している。また、植物のストレス応答14の文脈における膜マイクロドメインの役割のための証拠が増えている–16。
ここに記載されているプロトコルは、細胞膜マイクロドメインの分別のための堅牢な方法を提供し、特に、私たちは、ステロールが豊富な膜コンパートメント4,11,14のストレス誘発性の変化を描くことを可能にする界面活性剤濃度、タンパク質を使用しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文で提示プロトコルは、多くのステップが含まれており、それらのすべては、洗剤耐性膜と洗剤の可溶性画分に植物細胞膜の純粋で代表画を得ることが重要である。したがって、指示に従って、各ステップに従うことが重要である。
非イオン性界面活性剤（ステップ3.2）を用いて原形質膜画分の処理は、膜マイクロドメイン分別の品質に最も強い影響を有する。異?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
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