מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em> Thaliana ארבידופסיס</em> תא תרבויות השעיה
Summary
כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.
Abstract
microdomains קרום פלזמה הם תכונות המבוססות על התכונות הפיסיקליות של סביבת השומנים וסטרולים ויש תפקידים מסוימים באיתות תהליכים. חילוץ microdomains קרום מועשר בסטרולים מתאי צמח לניתוח proteomic הוא משימה קשה בעיקר בשל צעדי הכנה מרובים ומקורות לזיהומים מתאים סלולריים אחרים. קרום הפלזמה מהווה רק כ 5-20% מכל הקרומים בתא צמח, ולכן הבידוד של חלק קרום פלזמה מטוהר מאוד מאתגר. שיטה משמשת לעתים קרובות כרוכה מחיצות מימיות שני שלבים בפוליאתילן גליקול וdextran, אשר מניבה שלפוחית קרום פלזמה עם טוהר 95% 1. microdomains קרום סטרולים עשירים בתוך קרום הפלזמה הם מסיסים על טיפול עם חומרי ניקוי nonionic קרים ב-pH בסיסי. שבריר קרום אבקת עמידה זה יכול להיות מופרד מקרום הפלזמה כמויות גדולות על ידי ultracentrifugation כבשיפוע ucrose 2. בהמשך לכך, ניתן להפיק חלבונים מהלהקה הצפיפות הנמוכה של שיפוע סוכרוז על ידי משקעים מתנול / כלורופורם. חלבון המופק לאחר מכן ניתן יהיה טריפסין מתעכל, desalted ולבסוף נותח על ידי LC-MS/MS. פרוטוקול החילוץ שלנו לmicrodomains סטרולים עשירים מותאם במיוחד להכנה של שברים קרום נקיים חומרי ניקוי עמיד מתרביות תאי thaliana ארבידופסיס.
אנו משתמשים בתיוג טבולים מלא של תרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס עם 15 K NO 3 כמקור חנקן היחיד ללימודי proteomic השוואתיים כמותית לאחר טיפול ביולוגי של עניין 3. על ידי ערבוב יחסים שווים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית להפקת חלבון משותפת ההשפעה של צעדי הכנה בתוצאה הכמותית סופית נשמר במינימום. גם אובדן של חומר במהלך החילוץ ישפיע גם שליטה ודגימות טיפול באותה הדרך,ד ולכן היחס של אור ופפטיד התרומה יישאר קבוע. בשיטה המוצעת או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית עוברת טיפול ביולוגי, ואילו השני משמש כשליטה 4.
Introduction
ב1972, ג'ונתן סינגר וגארת' ניקולסון הציעו מודל פסיפס נוזל מודל מבנה ממברנות תאים, החלפת מודל כריך חלבון שומנים החלבון שהיה מקובל ב 1960s מוקדם. זינגר וניקולסון הניחו כי הקרום הביולוגי יכול להיחשב כנוזל דו ממדים שבו כל מולקולות השומנים וחלבונים מפוזרות באופן חופשי ובקלות 5. מאז אותה תקופה, מודל מבנה של קרום הפלזמה והידע של הרכב הקרום הפך למורכב עוד יותר. במיוחד, בתוך קרום הפלזמה, ניתן לראות מבנים כגון קומפלקסי חלבונים וmicrodomains מבני מסודר המבוסס שומנים / סטרולים. בממברנות מודל מלאכותיות 6,7, סטרולים וsphingolipids יכולים רוחבי להפריד ממינים שומנים אחרים כדי ליצור אזורים עם מאפיינים פיזיים שונים. הפרדה זו בתוך קרום התא נגרמת בעיקר על ידי מאפייני שיוך העצמי בין סטרולים וsa מאודשרשרות פחמימנים turated של phopsho וsphingolipids 8. במיוחד, טבעות סטרולים הנוקשה להעדיף אינטראקציות עם נוקשה ומיני שומנים ישר רוויים ואינטראקציות אלה יאלצו את שרשרות הפחמימנים שכנים ליותר תצורות מורחבות, הגדלת עובי קרום ואת קשיות.
אחד המאפיינים שנצפה של microdomains קרום סטרולים מועשרים היה insolubility על טיפול בחומרי ניקוי שאינו יוניים כגון טריטון X-100 או 35 בריג'. שברים אלה נחשבים לזהים עם microdomains קרום ונקראו קרומי סבון עמידים (DRM) המבוססים על שיטת ההכנה ביוכימיים שלהם 2. השימוש בחומרי ניקוי nonionic במהלך חילוץ DRM קיבלו ביקורת כהכנת ה-DRM ביוכימיים לא יכולה ישירות מתאימות לכל תא קרום ספציפי בתוך התא החי 9. במיוחד, חומרי הניקוי ליחס חלבון נראה מכריעים בהכנות כאלה,חומרי ניקוי של שונים, כמו גם כמויות חומרי ניקוי שונות יכול להניב הרכב של שבריר קרום אבקת עמידה 10 שונה. עם זאת, יש ראיות לכך שמיני חלבון מסוימים באופן ספציפי לקשר עם תחומים אלה קרום סלולארי סטרולים עשירים, ושחלבונים אלו מועשרים גם בהכנות ביוכימיים של שברים קרום אבקת עמידה 11. הליבה של חלבונים, שנמצאו בחלק ה-DRM צמח, ואשר הנוכחות בDRMs הייתה סטרולים תלויה, היו בעיקר חלבונים מעוגנים-GPI, כגון חלבונים כמו fasciclin-arabinogalactan (flas) ובני משפחת חלבון מק. גם כמה חלבוני איתות, כגון קינאזות כמו קולטן או phospholipases נמצאו 11. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים proteomic על microdomains קרום היונקים 12,13. גם בצמחים יש להגדיל ראיות לתפקיד של microdomains קרום בהקשר של תגובה ללחץ 14 –16.
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה חזקה לחלוקה של microdomains קרום פלזמה ובמיוחד משתמש בחלבון לריכוז חומר ניקוי שמאפשר לנו לתאר שינויי מתח מושרה של תא קרום סטרולים עשירים 4,11,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג במאמר זה מכיל שלבים רבים וכל אחד מהם הם חיוניים כדי להשיג חלוקה טהורה ונציג של קרום הפלזמה הצמח לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי. לכן, חשוב לעקוב אחר כל צעד בהתאם להנחיות.
טיפול בשבריר קרום הפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
References
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
- Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
- Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
- Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
- Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
- Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
- Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
- Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
- Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
- Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
- Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
- Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
- Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
- Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
- Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
- Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
- van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
- Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
- Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
- Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
- Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
- Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
- Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
- Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
- Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
- Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
- Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).
