ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في<em> C. ايليجانس</em> استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر
Summary
بينما الرنا المزدوج الجديلة التغذية في C. ايليجانس هو أداة قوية لتقييم وظيفة الجين والبروتوكولات الحالية للشاشات التغذية على نطاق واسع يؤدي إلى الكفاءة ضربة قاضية متغير. وصفنا بروتوكول محسنة لأداء نطاق واسع شاشات التغذية رني أن يؤدي إلى ضربة قاضية فعالة وقابلة للتكرار في التعبير الجيني.
Abstract
وقد تدخل الحمض النووي الريبي عن طريق تغذية الديدان البكتيريا معربا عن dsRNAs أداة مفيدة لتقييم وظيفة الجين في C. ايليجانس. بينما هذه الاستراتيجية يعمل بشكل جيد عندما يتم استهداف عدد صغير من الجينات لضربة قاضية، وشاشات التغذية على نطاق واسع تظهر الكفاءة ضربة قاضية المتغير، الأمر الذي يحد من فائدتها. لدينا فككت بروتوكولات ضربة قاضية رني المنشورة سابقا وجدت أن المصدر الرئيسي للانخفاض ضربة قاضية يمكن أن يعزى إلى فقدان البلازميدات الرنا المزدوج الجديلة ترميز من البكتيريا لتغذية الحيوانات. بناء على هذه الملاحظات، وقد وضعنا بروتوكولا التغذية الرنا المزدوج الجديلة أن يقلل إلى حد كبير أو فقدان يلغي البلازميد لتحقيق كفاءة وإنتاجية عالية ضربة قاضية. علينا أن نبرهن على هذا البروتوكول سوف تنتج قوية، تدق استنساخه من أسفل C. ايليجانس الجينات في أنواع الأنسجة المتعددة، بما في ذلك الخلايا العصبية، وسوف تسمح ضربة قاضية كفاءة في الشاشات على نطاق واسع. يستخدم هذا البروتوكول لتغذية الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريايصف مكتبة وجميع الخطوات اللازمة لتكرار مكتبة وأداء شاشات الرنا المزدوج الجديلة. لا يتطلب البروتوكول استخدام أي معدات متطورة، وبالتالي يمكن أن يقوم بها أي C. ايليجانس المختبر.
Introduction
تاريخيا، وشاشات جينية في C. وقد أجريت ايليجانس عن طريق التعامل مع الحيوانات المغير الكيميائية مثل إيثيل methanesulfonate لخلق طفرات عشوائية داخل الحمض النووي. ذرية أو grandprogeny الحيوانات mutagenized ثم يتم عزل هذا المعرض النمط الظاهري الشاذة المطلوب. ثم يتم التعرف على الطفرات المسؤولة عن التسبب في النمط الظاهري من خلال إجراء رسم الخرائط كثيفة العمالة أو عن طريق تسلسل جينوم دودة متحولة بأكمله. هناك العديد من المزايا لأداء مثل هذه الطفرات شاشات الكيميائية كما أنها تخلق آفات دائمة داخل الجينوم الدودة التي يمكن أن تؤدي في كل مكسب من وظيفة والخسارة من وظيفة الظواهر، ولكن الإجراء تعيين بطيئة ومكلفة.
تدخل الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط (dsRNAi) يوفر وسيلة بديلة لتحديد الجينات المسؤولة عن العمليات البيولوجية الهامة. في هذه الطريقة، يتم إدخال الرنا المزدوج الجديلة مطابقة تسلسل الترميز من الجين الذاتية في دودة.تتم معالجة الرنا المزدوج الجديلة في الجسم الحي لتوليد صغيرة (21-22 النوكليوتيدات) الرنا أن تكون بمثابة أدلة لإيجاد وربط mRNAs والذاتية مطابقة، واستهداف لهم لتدمير 1. هذا الإجراء سريع نسبيا، ولكن لأن الرنا المزدوج الجديلة يستهدف مرنا بدلا من الحمض النووي، ويلاحظ فقط الحد من وظيفة الظواهر باستخدام هذا النهج.
إدخال dsRNAs إلى حيوان لا يمكن أن يتحقق عن طريق الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة 2، عن طريق نقع الحيوانات في الرنا المزدوج الجديلة 3، أو عن طريق تغذية الحيوانات البكتيريا التي تعبر عن الرنا المزدوج الجديلة 4. كل من هذه الأساليب تسليم تتسبب في آثار ضربة قاضية النظامية لأن معظم خلايا الحيوان تعبير SID-1، قناة عبر الغشاء قادر على استيراد الرنا المزدوج الجديلة 5. كانت تستخدم أصلا لنهج الوراثة العكسية لضربة قاضية في التعبير عن الجينات فرد واحد في وقت واحد، وتطوير المكتبات التغذية اثنين يسمح الآن شاشات جينية واسعة النطاق. المكتبات الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريا تحتوي على درجة البكالوريوساستنساخ cterial تمثل 55٪ إما أو 87٪ من جميع C. ايليجانس الجينات 6، 7.
للأسف، غالبا ما تؤدي شاشات التغذية على نطاق واسع في dsRNAi الكفاءة ضربة قاضية متغير 8-10. في حين أن المستوى المطلق للضربة قاضية من قبل رني لا تقاس بسهولة، ويجب أن يكون السبب في انخفاض الكفاءة ضربة قاضية لوحظ في الشاشات على نطاق واسع من قبل mRNAs والجينات المحددة المتبقية التي تفلت التحلل بواسطة رني. هذا، بدوره، يمكن أن يكون نتيجة مباشرة لفقدان الرنا المزدوج الجديلة البلازميد من البكتيريا تتغذى على الحيوانات في هذه الشاشات. دعم هذه الفكرة، الحيوانات التي تتغذى خليط من البكتيريا، والتي 50٪ فقط من البكتيريا التعبير عن dsRNAs ضد الجينات المستهدفة، تظهر خفضت بشكل كبير (إن وجدت) آثار ضربة قاضية مقارنة للسيطرة على الحيوانات التي تتغذى 11. مدى ضربة قاضية الجينات يصبح مصدر قلق بالغ عند تنفيذ شاشات dsRNAi حيث أن معظم الجينات في C. ايليجانس هي haplosufficient وبالتالي يجب تخفيض التعبير الجيني بنسبة 50٪ على الأقل رس يسبب خسارة من الظواهر وظيفة 12.
وقد استخدمنا بروتوكولات التغذية المنشورة سابقا لأداء شاشات واسعة النطاق، ووجدت نفس آثار ضربة قاضية متغير ذكرت من قبل الآخرين 8-10. في البحث عن الأسباب المحتملة، وجدنا أن ما يقرب من 60٪ من البكتيريا تتغذى على الحيوانات في الشاشة فقدت البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. قمنا بتطوير مكتبة الازدواجية والفحص البروتوكول الذي يقلل بشكل كبير أو يلغي خسارة البلازميد ويحسن إلى حد كبير كفاءة ضربة قاضية. هذا البروتوكول هو مناسبة لأداء شاشات نطاق واسع في C. ايليجانس ويمكن استخدامها لفحص أي واحد من المكتبات الرنا المزدوج الجديلة متاحة تجاريا. باستخدام هذا البروتوكول، نجد أن الأساس 100٪ من البكتيريا تتغذى على الحيوانات خلال الشاشة الاحتفاظ البلازميد الرنا المزدوج الجديلة ترميز وتسبب خسارة قوية وتوغل للغاية من الظواهر الدالة في جميع الأنسجة فحصها.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها البروتوكول الذي يستخدم مكتبة التغذية الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريا لأداء شاشات واسعة النطاق في C. ايليجانس. نحن نقدم جميع التعليمات لتكرار المكتبة واستخدامها بفعالية. علينا أن نظهر أن هذا النهج قادر على تحديد الجينات المسؤولة عن العمليات البيول?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الوطنية للصحة MH097163. وقدمت بعض سلالات من قبل CGC، الذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة مكتب برامج البنية التحتية للبحوث (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
References
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
