Groß Gene Knockdown in<em> C. elegans</em> Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren
Summary
Während dsRNA Fütterung in C. elegans ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Genfunktionen, aktuellen Protokolle für große Bildschirme Fütterung führen zu variablen Zuschlags Effizienz zu beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Protokoll für die Durchführung groß angelegte RNAi Fütterung Bildschirme, die in hochwirksame und reproduzierbare Zuschlags der Genexpression resultiert.
Abstract
RNA-Interferenz, indem Würmer Bakterien, die dsRNA ist ein nützliches Werkzeug, um Genfunktionen in C. bewerten elegans. Während diese Strategie funktioniert gut, wenn eine kleine Anzahl von Genen für die Zuschlags gezielte, Groß Fütterung Bildschirme zeigen variable Zuschlagswirkungsgrade, was ihre Verwendbarkeit einschränkt. Wir haben zuvor veröffentlichten Protokollen RNAi Zuschlags zerlegt und festgestellt, dass die Hauptquelle der reduzierten Zuschlags kann zum Verlust von dsRNA kodierende Plasmide aus den an die Tiere verfüttert werden Bakterien zugeschrieben werden. Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir eine dsRNA Fütterungsprotokoll, das stark reduziert oder eliminiert Plasmid Verlust effiziente Hochdurchzuschlags erreichen entwickelt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll wird robust, reproduzierbar Knock Down von C. produzieren elegans Gene in mehreren Gewebetypen, einschließlich Neuronen und eine effiziente Knockdown in Großbildschirme ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet eine kommerziell erhältliche dsRNA ZufuhrBibliothek und beschreibt alle notwendigen Schritte, um die Bibliothek zu kopieren und auszuführen dsRNA-Bildschirme. Das Protokoll erfordert nicht die Verwendung von hoch entwickelten Geräten, und kann daher von einem C durchgeführt werden elegans Labor.
Introduction
Historisch genetische Screens in C. elegans durch die Behandlung von Tieren mit einem chemischen Mutagen wie Ethylmethansulfonat um zufällige Mutationen in DNA erstellen durchgeführt worden. Nachkommen-oder grandprogeny mutagenisierter Tiere werden dann isoliert, die Ausstellung eines gewünschten abnorme Phänotyp. Der zum Bewirken des Phänotyps verantwortlich Mutation in einem arbeitsintensiven Abbildungsverfahren oder durch Sequenzierung der mutierten Wurm gesamte Genom identifiziert. Es gibt viele Vorteile bei der Durchführung dieser chemischen Mutagenese-Läsionen, wie sie permanent innerhalb des Genoms, die Schnecke in beiden gain-of-function-und Verlust-von-Funktion Phänotypen erzeugen kann, aber die Zuordnungsverfahren ist langsam und teuer.
Doppelsträngige RNA-Interferenz (dsRNAi) stellt ein alternatives Mittel, um Gene in wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. Bei diesem Verfahren wird entsprechend der dsRNA kodierende Sequenz eines endogenen Gens in das Schnecken eingeführt.Die dsRNA wird in vivo verarbeitet, um kleine (21-22 Nukleotid) RNAs, die als Führer zu finden und zu binden, die passenden endogenen mRNAs, anzusprechen, für die Zerstörung 1 dienen generieren. Dieses Verfahren ist relativ schnell, sondern weil dsRNA zielt mRNA statt DNA werden nur Reduktions-of-function-Phänotypen mit Hilfe dieses Ansatzes beobachtet.
Einführung von dsRNA in ein Tier durch direkte Injektion von dsRNA 2 erreicht werden, durch Einweichen in Tieren dsRNA 3, oder durch Füttern von Tieren Bakterien, 4 dsRNA exprimieren. Jede dieser Versandmethoden verursachen systemische Zuschlags Auswirkungen, da die meisten Zellen des Tieres äußern SID-1, eine Transmembrankanal importiert werden können dsRNA 5. Ursprünglich als Reverse Genetik Ansatz, um die Expression einzelner Gene ein zu einer Zeit Knockdown verwendet, die Entwicklung der beiden Speise Bibliotheken ermöglicht nun groß angelegte genetische Bildschirme. Die im Handel erhältlichen dsRNA Bibliotheken enthalten bacterial Klone, die entweder 55% oder 87% aller C. elegans Gene 6, 7.
Leider Groß dsRNAi Fütterung Bildschirme oft in variablen Zuschlagswirkungsgrade 8-10 führen. Während die absolute Höhe der Zuschlags durch RNAi ist nicht leicht zu messen, muss die in großen Bildschirmen beobachtet reduziert Zuschlags Effizienz durch Rest Gen-spezifischen mRNAs, die Verschlechterung zu entkommen durch RNAi verursacht werden. Dies könnte wiederum ein direktes Ergebnis der dsRNA Plasmid Verlust von Bakterien, Tieren in diesen Bildern zugeführt werden. Die Unterstützung dieser Idee, Tiere verfüttert Mischungen von Bakterien, in der nur 50% der Bakterien auszudrücken dsRNA gegen eine Zielgens, zeigen drastisch reduziert (wenn überhaupt) Knockdown-Effekte im Vergleich zu Tieren gefüttert 11 zu steuern. Das Ausmaß der Gen-Knockdown zu einem kritischen Anliegen bei der Durchführung dsRNAi-Bildschirme wie die meisten Gene in C. elegans sind haplosufficient und somit muss der Genexpression durch mindestens 50% t reduziert werden,o führen loss-of-function Phänotypen 12.
Wir haben bisher veröffentlichten Fütterungsprotokolle verwendet werden, um große Bildschirme durchführen und fand die gleiche Variable Zuschlags Effekte von anderen 10.08 ausgewiesen. Bei der Suche nach möglichen Ursachen, fanden wir, dass fast 60% der Tiere in den Bildschirm eingespeist Bakterien hatten die dsRNA-Plasmid verloren. Wir haben eine Bibliothek Vervielfältigung und Screening-Protokoll, die drastisch reduziert oder eliminiert Plasmid Verlust und verbessert die Zuschlags Effizienz entwickelt. Dieses Protokoll ist für die Durchführung von Großbildschirmen in C. elegans und können zum Screening einer von der kommerziell erhältlichen dsRNA Bibliotheken werden. Über dieses Protokoll, finden wir, dass praktisch 100% der zu den Tieren während der Bildschirm eingespeist Bakterien behalten die dsRNA-kodierenden Plasmid verursachen und robust und sehr penetrant Verlust der Funktion Phänotypen in allen untersuchten Geweben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein Protokoll, das einen im Handel erhältlichen Futter dsRNA-Bibliothek verwendet, um große Bildschirme in C durchzuführen beschrieben elegans. Wir bieten alle Anweisungen, die Bibliothek zu kopieren und es effektiv zu nutzen. Wir zeigen, dass dieser Ansatz in der Lage ist, Gene in verschiedenen biologischen Prozessen in verschiedenen Geweben der Tiere beteiligt sind. Während die Phänotypen wir hier beschreiben, sind leicht zu beobachten (UNC, Egl und Dpy), kann dieses Protokoll angepass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den National Institutes of Health MH097163 unterstützt. Einige Stämme wurden von der CGC, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40-OD010440) gefördert wird.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
References
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
