Su larga scala Knockdown Gene in<em> C. elegans</em> Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione
Summary
Mentre dsRNA alimentazione in C. elegans è un potente strumento per valutare la funzione del gene, i protocolli attuali schermi di alimentazione su larga scala producono efficienze atterramento variabili. Descriviamo un protocollo migliorato per eseguire larga scala RNAi schermi alimentazione che si traduce in knockdown altamente efficace e riproducibile di espressione genica.
Abstract
RNA interference alimentando worm batteri che esprimono dsRNAs è stato uno strumento utile per valutare la funzione del gene in C. elegans. Mentre questa strategia funziona bene quando un piccolo numero di geni sono mirati per atterramento, schermi alimentazione larga scala mostrano efficienze abbattibili variabili, che limita la loro utilità. Abbiamo decostruito protocolli smontabili RNAi precedentemente pubblicati e trovato che la fonte primaria del knockdown ridotta può essere attribuita alla perdita di plasmidi codificanti dsRNA dai batteri somministrati agli animali. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo sviluppato un protocollo di alimentazione dsRNA che riduce notevolmente o elimina la perdita di plasmide per ottenere efficienza, alta knockdown produttività. Abbiamo dimostrato che questo protocollo produrrà robusto, colpo riproducibile giù di C. elegans geni in diversi tipi di tessuto, tra cui i neuroni, e consentiranno atterramento efficiente in schermi di grandi dimensioni. Questo protocollo utilizza un'alimentazione dsRNA disponibile in commerciobiblioteca e descrive tutti i passi necessari per duplicare la libreria ed eseguire schermi dsRNA. Il protocollo non richiede l'uso di attrezzature sofisticate, e può pertanto essere eseguita con qualsiasi C. elegans laboratorio.
Introduction
Storicamente, gli schermi genetiche in C. elegans sono state effettuate considerando gli animali con un mutageno chimico come metansolfonato etilico per creare mutazioni casuali entro DNA. Progenie o grandprogeny di animali mutagenizzate vengono poi isolate che mostrano un fenotipo anormale se lo desideri. La mutazione responsabile per provocare il fenotipo viene quindi identificato mediante una procedura di mappatura laborioso o mediante sequenziamento dell'intero genoma del verme mutante. Ci sono molti vantaggi per l'esecuzione di tali schermi di mutagenesi chimica creano lesioni permanenti all'interno del genoma worm che possono provocare entrambi i fenotipi guadagno-di-funzione e perdita di funzione, ma la procedura di mappatura è lento e costoso.
Double-stranded RNA interference (dsRNAi) fornisce un mezzo alternativo per identificare i geni coinvolti in importanti processi biologici. In questo metodo, dsRNA corrispondente alla sequenza codificante di un gene endogeno viene introdotto nel verme.Il dsRNA viene elaborato in vivo di generare piccole (21-22 nucleotidi) RNA che fungono da guida per trovare e fermare il mRNA endogeni corrispondenti, rivolgersi a loro per la distruzione 1. Questa procedura è relativamente breve, ma perché dsRNA obiettivi mRNA anziché DNA, solo fenotipi riduzione di funzione sono osservati utilizzando questo approccio.
Introduzione di dsRNA in un animale può essere ottenuto mediante iniezione diretta di dsRNA 2, immergendo animali in dsRNA 3, o somministrate animali batteri che esprimono dsRNA 4. Ciascuno di questi metodi di consegna causare effetti atterramento sistemici come la maggior parte delle cellule dell'animale esprimono SID-1, un canale transmembrana in grado di importare dsRNA 5. Originariamente utilizzato come un approccio di genetica inversa per knockdown l'espressione di diversi geni uno alla volta, lo sviluppo di due librerie di alimentazione permette ora schermi genetici su larga scala. Le librerie dsRNA disponibili in commercio contengono bacloni cterial che rappresentano sia il 55% o il 87% di tutti i C. elegans geni 6, 7.
Purtroppo, su larga scala schermi di alimentazione dsRNAi spesso sfociano in efficienza atterramento variabili 8-10. Mentre il livello assoluto di atterramento da RNAi non è facilmente misurabile, l'efficienza atterramento riduzione osservata in schermi di grandi dimensioni deve essere causata da mRNA specifico gene residue che sfuggono alla degradazione da RNAi. Questo, a sua volta, potrebbe essere un risultato diretto di dsRNA perdita plasmidico da batteri somministrati ad animali in queste schermate. A supporto di questa idea, animali alimentati con miscele di batteri, in cui solo il 50% dei batteri esprimono dsRNAs contro un gene targeting, mostrano drasticamente ridotto (eventuali) effetti knockdown rispetto agli animali di controllo alimentati 11. L'entità del gene knockdown diventa un problema critico durante l'esecuzione di schermi dsRNAi come la maggior parte dei geni di C. elegans sono haplosufficient e quindi l'espressione genica devono essere ridotte almeno del 50% to causare la perdita-di-funzione fenotipi 12.
Abbiamo usato protocolli di alimentazione precedentemente pubblicati effettuare schermi di grandi dimensioni e trovato gli stessi effetti smontabili variabili riportati da altri 8-10. In una ricerca di possibili cause, abbiamo riscontrato che quasi il 60% dei batteri alimentati agli animali nella schermata aveva perso il plasmide dsRNA. Abbiamo sviluppato una duplicazione e di screening protocollo biblioteca che riduce drasticamente o elimina la perdita di plasmide e migliora notevolmente l'efficienza knockdown. Questo protocollo è adatto per l'esecuzione di schermi di grandi dimensioni in C. elegans e può essere usata per selezionare uno dei due librerie dsRNA disponibili in commercio. Usando questo protocollo, troviamo che sostanzialmente il 100% dei batteri somministrati ad animali durante la schermata mantenere il plasmide dsRNA-codifica e causare la perdita robusto e altamente penetrante dei fenotipi funzione in tutti i tessuti esaminati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto un protocollo che utilizza una libreria alimentazione dsRNA disponibile in commercio per eseguire schermi di grandi dimensioni in C. elegans. Forniamo tutte le istruzioni per duplicare la biblioteca e per usarlo in modo efficace. Abbiamo dimostrato che questo approccio è in grado di identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici in differenti tessuti dell'animale. Mentre i fenotipi che descriviamo qui sono facilmente osservabili (Unc, Egl, e Dpy), questo protocollo può esser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal National Institutes of Health MH097163. Alcuni ceppi sono stati forniti dalla CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH di programmi di infrastrutture di ricerca (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
References
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
