À grande échelle Gene Knockdown dans<em> C. elegans</em> Utilisation ARNdb alimentation bibliothèques pour générer des phénotypes robustes perte de fonction
Summary
Bien que l'ARN double brin d'alimentation en C. elegans est un outil puissant pour évaluer la fonction des gènes, les protocoles actuels pour les écrans d'alimentation à grande échelle entraînent des économies de knockdown variables. Nous décrivons un protocole amélioré pour réaliser des écrans d'alimentation d'ARNi à grande échelle qui se traduit par effet de choc très efficace et reproductible de l'expression génique.
Abstract
L'interférence ARN en se nourrissant de vers bactéries exprimant des ARN double brin a été un outil utile pour évaluer la fonction des gènes dans C. elegans. Bien que cette stratégie fonctionne bien quand un petit nombre de gènes sont ciblés pour effet de choc, écrans d'alimentation à grande échelle montrent l'efficacité de knockdown variables, ce qui limite leur utilité. Nous avons déconstruit protocoles de knockdown ARNi déjà publiées et a constaté que la principale source de l'effet de choc réduite peut être attribuée à la perte de plasmides ARNdb codant des bactéries nourris aux animaux. Sur la base de ces observations, nous avons développé un protocole d'alimentation ARN double brin qui réduit ou élimine la perte de plasmide de réaliser avec efficacité, effet de choc à haut débit grandement. Nous démontrons que ce protocole va produire robuste, reproductible coup bas de C. elegans gènes dans différents types de tissus multiples, y compris les neurones, et permettront knockdown efficace dans les grands écrans de grande envergure. Ce protocole utilise un ARN double brin alimentation disponible dans le commercebibliothèque et décrit toutes les étapes nécessaires pour reproduire la bibliothèque et effectuer écrans ARN double brin. Le protocole ne requiert pas l'utilisation de tout équipement sophistiqué, et peut donc être réalisée par toute C. elegans laboratoire.
Introduction
Historiquement, les écrans génétiques dans C. elegans ont été réalisées par le traitement des animaux avec un agent mutagène chimique tel que le méthanesulfonate d'éthyle pour créer des mutations aléatoires dans l'ADN. Descendance ou grandprogeny des animaux ayant subi une mutagénèse sont ensuite isolés qui présentent un phénotype anormal souhaitée. La mutation responsable de causer le phénotype est alors identifié par une procédure de cartographie de main-d'œuvre ou par séquençage de tout le génome du ver mutant. Il ya de nombreux avantages à l'exécution de ces écrans de mutagenèse chimique car ils créent des lésions permanentes au sein du génome du ver qui peuvent résulter dans les deux phénotypes gain de fonction et la perte de fonction, mais la procédure de cartographie est lent et coûteux.
Interférence de l'ARN double brin (dsRNAi) fournit un autre moyen pour identifier les gènes impliqués dans des processus biologiques importants. Dans ce procédé, l'ARN double brin correspondant à la séquence codante d'un gène endogène est introduite dans la vis sans fin.L'ARNdb est traitée in vivo pour générer de petites (21-22 nucléotides) ARN qui servent de guides pour trouver et se lient les ARNm endogènes correspondants, en les ciblant pour la destruction 1. Cette procédure est relativement rapide, mais parce que l'ARN double brin cible ARNm plutôt que l'ADN, seuls phénotypes réduction de fonction sont observées en utilisant cette approche.
Introduction d'ARN double brin dans un animal peut être réalisée par injection directe de l'ARN double brin 2, en trempant les animaux dans ARNdb 3, ou par l'alimentation des animaux des bactéries qui expriment des ARN double brin 4. Chacune de ces méthodes de livraison entraîner des effets systémiques knockdown que la plupart des cellules de l'animal expriment SID-1, un canal transmembranaire capable d'importer des ARN double brin 5. Initialement utilisé comme une approche de génétique inverse pour knockdown de l'expression des gènes individuels un à la fois, le développement de deux bibliothèques d'alimentation permet maintenant écrans génétiques à grande échelle. Les bibliothèques ARNdb disponibles dans le commerce contiennent baclones cterial représentant soit 55% ou 87% de l'ensemble C. elegans gènes 6, 7.
Malheureusement, écrans dsRNAi d'alimentation à grande échelle se traduisent souvent par l'efficacité de knockdown variables 8-10. Alors que le niveau absolu de knockdown par ARNi n'est pas facile à mesurer, l'efficacité de knockdown réduite observée dans de grands écrans d'échelle doit être causé par des ARNm spécifiques du gène résiduelles qui échappent dégradation par ARNi. Ceci, à son tour, pourrait être une conséquence directe de la perte de l'ARN double brin plasmidique à partir de bactéries à des animaux nourris dans ces écrans. L'appui de cette idée, les animaux nourris des mélanges de bactéries, dont seulement 50% des bactéries exprimer ARNdb contre un gène ciblé, montrent considérablement réduit (le cas échéant) des effets knockdown par rapport aux animaux témoins nourris 11. L'étendue de la inactivation génique devient une préoccupation essentielle lors de l'exécution écrans dsRNAi que la plupart des gènes dans C. elegans sont haplosufficient et donc l'expression des gènes doivent être réduites d'au moins 50% to causer la perte de fonction de 12 phénotypes.
Nous avons utilisé les protocoles d'alimentation précédemment publiées pour effectuer grands écrans et trouvé les mêmes effets knockdown variables signalées par d'autres 8-10. Dans une recherche des causes possibles, nous avons constaté que près de 60% des bactéries alimentation des animaux dans l'écran avait perdu le plasmide ARN double brin. Nous avons développé une duplication et le dépistage protocole bibliothèque qui réduit considérablement ou élimine la perte de plasmide et améliore grandement l'efficacité knockdown. Ce protocole est apte à effectuer de grands écrans d'échelle dans C. elegans et peut être utilisé pour cribler une ou l'autre des bibliothèques d'ARNdb disponibles dans le commerce. En utilisant ce protocole, nous constatons que pratiquement 100% des bactéries alimentation des animaux pendant l'écran de conserver le plasmide codant l'ARN double brin et causer la perte robuste et très pénétrant de phénotypes de fonction dans tous les tissus examinés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit un protocole qui utilise une bibliothèque d'alimentation ARNdb disponible dans le commerce pour effectuer les écrans de grande envergure dans C. elegans. Nous fournissons toutes les instructions pour dupliquer la bibliothèque et de l'utiliser efficacement. Nous démontrons que cette approche permet d'identifier des gènes impliqués dans divers processus biologiques dans différents tissus de l'animal. Alors que les phénotypes que nous décrivons ici sont facilement observ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts nationaux de la santé MH097163. Certaines souches ont été fournis par la CCG, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d'infrastructure de recherche (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
References
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