Storskalig Gene Knockdown i<em> C. elegans</em> Med hjälp av dsRNA Feeding bibliotek för att generera Robust förlust-av-funktion Fenotyper

Summary

Medan dsRNA utfodring i C. elegans är ett kraftfullt verktyg för att bedöma geners funktion, löpande protokoll för storskaliga utfodring skärmar resultera i variabla knockdown effektivitet. Vi beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra storskaliga RNAi utfodring skärmar som resulterar i mycket effektiv och reproducerbar knockdown av genuttryck.

Abstract

RNA-interferens genom att mata maskar bakterier som uttrycker dsRNAs har varit ett användbart verktyg för att bedöma geners funktion i C. elegans. Även denna strategi fungerar bra när ett litet antal gener är riktade för knockdown, storskaliga utfodring skärmar visar variabla knockdown effektivitet, vilket begränsar deras användbarhet. Vi har ratas tidigare publicerade RNAi knockdown-protokoll och fann att den primära källan för det reducerade knockdown kan tillskrivas förlusten av dsRNA-kodande plasmider från bakterierna ges till djuren. Baserat på dessa observationer, har vi utvecklat en dsRNA utfodring protokoll som kraftigt reducerar eller eliminerar plasmidförlust att uppnå effektiv, hög genomströmning knockdown. Vi visar att detta protokoll kommer att producera robust, reproducerbar knock ned av C. elegans gener i olika vävnadstyper, inklusive nervceller, och kommer att möjliggöra effektiv knockdown i storskaliga skärmar. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodringbibliotek och beskriver alla steg som behövs för att duplicera biblioteket och utföra dsRNA skärmar. Protokollet kräver inte användning av någon avancerad utrustning, och kan därför utföras av alla C. elegans labb.

Introduction

Historiskt, genetiska skärmar i C. elegans har utförts genom att behandla djur med en kemisk mutagen såsom etylmetansulfonat för att skapa slumpmässiga mutationer i DNA. Progeny eller grandprogeny av muterade djur isoleras sedan som uppvisar en önskad onormal fenotyp. Mutationen som förorsakat fenotypen sedan identifieras genom en arbetsintensiv kartläggning förfarande eller genom sekvensering av mutant mask hela arvsmassa. Det finns många fördelar med att utföra sådana kemiska mutagenes skärmar eftersom de skapar permanenta skador inom masken genomet som kan resultera i både vinst-av-funktion och förlust-av-funktion fenotyper, men kartläggningen förfarandet är långsamt och dyrt.

Dubbel-RNA interferens (dsRNAi) ger ett alternativt sätt för att identifiera gener som är involverade i viktiga biologiska processer. I denna metod är dsRNA matcha den kodande sekvensen av en endogen gen införes i masken.Den dsRNA bearbetas in vivo för att generera små (21-22 nukleotider) RNA som fungerar som guider för att hitta och binda matchande endogena mRNA, rikta dem till destruktion ^1. Detta förfarande är relativt snabb, men eftersom dsRNA riktar mRNA istället för DNA, är endast minskning-av-funktion fenotyper observerats med hjälp av denna metod.

Införande av dsRNA i ett djur kan åstadkommas genom direkt injektion av dsRNA ^2, genom att blötlägga djur i dsRNA ^3, eller genom att mata djur bakterier som uttrycker dsRNA ^4. Var och en av dessa administreringsmetoder orsaka systemknockdown effekter eftersom de flesta celler i djuret uttrycka SID-1, en ​​transmembrankanal som medger import dsRNA ^5. Ursprungligen användes som en omvänd genetik tillvägagångssätt att knockdown uttrycket av enskilda gener en i taget, tillåter utveckling av två bibliotek utfodring nu storskaliga genetiska skärmar. De kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek innehåller bacterial kloner som representerar antingen 55% eller 87% av alla C. elegans gener ^{6, 7.}

Tyvärr, storskaliga dsRNAi utfodring skärmar ofta resultera i variabla knockdown effektivitet ^8-10. Medan den absoluta nivån på knockdown av RNAi inte är lätt att mäta, måste den minskade knockdown effektivitet observerats i storskaliga skärmar orsakas av kvarvarande genspecifika mRNA som undgår nedbrytning av RNAi. Detta, i sin tur, skulle kunna vara en direkt följd av dsRNA plasmidförlust från bakterier ges till djur i dessa skärmar. Stöd denna idé, djur utfodras blandningar av bakterier, i vilken endast 50% av de bakterier som uttrycker dsRNAs mot en målinriktad gen, show dramatiskt reduceras (om några) knockdown effekter jämfört med kontroll utfodrade djur ^11. Omfattningen av genen knockdown blir en viktig fråga när du utför dsRNAi skärmar som de flesta gener i C. elegans är haplosufficient och därmed genuttryck måste minskas med minst 50% to orsaka förlust-av-funktion fenotyper ^12.

Vi har använt tidigare publicerade utfodring protokoll för att utföra storskaliga skärmar och fann samma variabla knockdown som rapporterats av andra ^8-10. I ett sökande efter möjliga orsaker, fann vi att nästan 60% av de bakterier som ges till djur i skärmen hade förlorat dsRNA plasmiden. Vi har utvecklat ett bibliotek dubbelarbete och screeningprotokoll som dramatiskt minskar eller eliminerar plasmidförlust och kraftigt förbättrar knockdown effektivitet. Detta protokoll är lämpligt för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans och kan användas för att screena antingen en av de kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek. Med hjälp av detta protokoll, finner vi att i huvudsak 100% av de bakterier som ges till djur under skärmen behåller dsRNA-kodande plasmiden och orsaka robust och mycket penetrerande förlorad funktion fenotyper i alla vävnader som undersökts.

Protocol

Anmärkning: Detta protokoll kan användas för att identifiera gener som krävs för en mängd olika biologiska processer i en mängd olika vävnadstyper. Som en nödvändig kvalitetskontroll under skärmen, djuren utfodras både positiva och negativa kontroll dsRNA-uttryckande bakterier att visa RNAi effekter i den riktade vävnaden. Andra publicerade utfodringsprotokoll växa dsRNA-uttryckande bakterier i närvaro av antingen 50 ng / ml ampicillin eller 25 | ig / ml karbenicillin…

Representative Results

P0 knockdown fenotyper kommer att börja visas efter 2-3 dagars mata djuren dsRNA uttrycka bakterier. Några tidiga fenotyper omfattar larv gripande och dödlighet och bör observeras i 2-3% av alla utfodring brunnar. Samma fenotyper kommer också att observeras i F1 generationen djuren. Förekomsten av F1 ägg som inte kläcks är en annan vanlig F1-fenotyp, och tillsammans kommer dessa tre fenotyper observeras i nästan 10% av alla brunnar i F1-skärmar. Vi använde det protokoll som beskr…

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll som använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodring bibliotek för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans. Vi erbjuder alla instruktioner att duplicera biblioteket och att använda den på ett effektivt sätt. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera gener som är involverade i olika biologiska processer i olika vävnader hos djuret. Medan de fenotyper som vi beskriver här är lätt att observera (Unc, Egl och Dpy), kan detta protokoll anpassas för a…

Materials

			Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate	Fisher Scientific	353072	sterile
adhesive foil	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock	USA Scientific	5678-0285	autoclavable
Lids for deep well plates	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	individually wrapped
Reservoir	USA Scientific	2977-8500	autoclavable
12-well plates	USA Scientific	CC7682-7512	individually wrapped
dsRNA feeding library	OpenBiosystems	RCE1181	store -80 °C
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912-100
Carbenicillin			allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A	Affymetrix	10906	for worm plates
			Equipment
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
Boekel 96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	autoclavable
microshaker	Thomas Scientific	1231A93	3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl)	USA Scientific	7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus manual pipettor	USA Scientific	4026-0201