قياس إجمالي الكالسيوم في الخلايا العصبية بواسطة الكترون مسبار الأشعة السينية التحليل المجهري
Summary
وتصف هذه الورقة تطبيق cryoanalytical المجهر الإلكتروني لقياس الكمي من مجموع محتوى الكالسيوم وتوزيعه في قرار التحت خلوية في العينات البيولوجية المحددة من الناحية الفسيولوجية.
Abstract
في هذه المقالة موصوفة الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكمي للمحتوى عنصري داخل الخلايا باستخدام تقنية تعرف باسم المسبار الإلكترون التحليل الدقيق (EPMA). Intramitochondrial الكالسيوم هو التركيز بشكل خاص نظرا للدور الحيوي الذي تلعبه الزائد الكالسيوم الميتوكوندريا في أمراض الاعصاب. ويستند الأسلوب على تحليل الأشعة السينية ولدت في المجهر الإلكتروني (EM) من خلال التفاعل بين شعاع الالكترون مع العينة. من أجل الحفاظ على التوزيع الأصلي من عناصر إنتشاري في الإلكترون المجهري العينات، يتطلب EPMA "cryofixation" من الأنسجة يليها إعداد cryosections سامسونج. ويتم تجميد السريع للخلايا المستزرعة أو الثقافات شريحة عضوي النمط من قبل يغرق في الإيثان السائل تجميد أو عن طريق البطولات الاربع تجميد ضد كتلة معدنية باردة، على التوالي. Cryosections أبعاده يتم قطع 80 نانومتر سميكة جافة بسكين الماس في كاليفورنيا. -16076؛ C، التي شنت على الكربون / المغلفة pioloform شبكات النحاس، وcryotransferred في البرد EM باستخدام حامل cryospecimen المتخصصة. بعد المسح ورسم الخرائط البصرية في موقع ≤ -160 درجة مئوية، والإلكترون جرعة منخفضة، cryosections المجمدة رطب هي في -100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~ تجميد المجفف. وتسجل الصور على مستوى عضية من cryosections المجففة، وأيضا في جرعة منخفضة، عن طريق كاميرا CCD بطيئة مسح والمناطق التحت خلوية من الفائدة المحددة للتحليل. يتم جمع الأشعة السينية المنبعثة من رويس من قبل ثابتة ومركزة وعالية الكثافة التحقيق الإلكترون عن طريق الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) مطياف، التي تتم معالجتها بواسطة الإلكترونيات المرتبطة بها، وقدم بوصفه الطيف بالأشعة السينية، وهذا هو، مؤامرة من كثافة الأشعة السينية مقابل الطاقة. برامج إضافية تسهل: 1) تحديد مكونات عنصري بحكم "مميزة" الطاقات الذروة وبصمة؛ و 2) التحليل الكمي من خلال استخراج المناطق الذروة / الخلفية. ويختتم هذه الورقة مع اثنين من الأمثلة التي توضح نموذجيةتطبيقات EPMA، واحدة في التي وفرت تحليل الكالسيوم الميتوكوندريا البصيرة الحاسمة في آليات الاصابة excitotoxic المواد وآخر كشفت أساس مقاومة نقص التروية.
Introduction
أيونات الكالسيوم ويمكن القول إن الكيان إشارة الخلية الأكثر أهمية وتنوعا في علم الأحياء، ولعب دورا أساسيا في العمليات العادية متنوعة مثل انتقال متشابك والتعبير الجيني. من ناحية أخرى، والكالسيوم المهم أيضا في موت الخلايا. على وجه الخصوص، ورفع القيود الكالسيوم هو عامل أساسي في الإصابة العصبية في المخ والشلل الرعاش والزهايمر والأمراض العصبية الأخرى 3،5. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم كميا كيفية توزيع الكالسيوم داخل الخلايا، وكيف يتغير هذا المنبهات الفسيولوجية التالية أو المرضية في جسم المريض. معقد هذا الهدف من خلال حقيقة أن الكالسيوم يتم توزيعها بشكل حيوي بين دولتين المادية – الحرة في حل أو منضما إلى الركيزة – وأن تركيزات الكالسيوم الخلوية تغيير على مدى عدة أوامر من حجمها نتيجة التحفيز.
في حين أن هناك العديد من المنهجيات المتقدمة المتاحة لتحليل الابهه الكالسيوم داخل الخلايا، وتحديد تركيزات الكالسيوم الكلي في حجرات داخل الخلايا المحددة يقتصر واقعيا لنهج واحد، وهما الإلكترون التحقيق التحليل الدقيق (EPMA). EPMA هو الاسلوب الذي الأزواج مطياف الأشعة السينية إلى المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). بندقية الإلكترون تيم يركز على القرطاسية وsubmicron التحقيق الإلكترون على المنطقة التحت خلوية من الفائدة والأشعة السينية المنبعثة عنصر محددة نتيجة القصف الإلكترون يتم جمعها وتحليلها (انظر المراجع 7، 4 للاستعراضات الفنية التفصيلية). وتشمل مزايا EPMA القرار على مستوى عضية واحدة وحساسية submillimolar. في الممارسة العملية، ومع ذلك، يتطلب EPMA cryotechniques المتخصصة والأجهزة لإعداد العينات وتحليلها. هنا، يتم وصف الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام EPMA. Intramitochondrial الكالسيوم ط خاصةnterest بسبب الدور الحاسم الذي الميتوكوندريا المسرحيات الزائد الكالسيوم في أمراض الاعصاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
المنهج التحليلي القائم على المجهر الالكتروني المقدمة هنا يسمح للكشف، وتحديد، وتحديد الكميات من عدة عناصر ذات الأهمية البيولوجية، بما في ذلك نا، K، P، وخاصة الكالسيوم. ويمكن إجراء هذه التحاليل في التحت خلوية، أي داخل عضية، القرار بسبب القدرة على اكتشاف وتحديد هي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر السيدة كريستين A. الشتاء للحصول على مساعدة فنية ممتازة. وأيد هذا العمل من قبل برنامج العلوم العصبية الأساسية للبرنامج NINDS جماعية البحوث، المعاهد الوطنية للصحة (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
