מדידה של סידן סה"כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe
Summary
מאמר זה מתאר את היישום של מיקרוסקופיה האלקטרונית cryoanalytical למדידת כמותית של תוכן הכולל סידן והפצה ברזולוציה subcellular בדגימות ביולוגיות מוגדרות מבחינה פיזיולוגית.
Abstract
במאמר זה את הכלים, טכניקות, והכלים מתאימים למדידות כמותיות של תוכן יסודות תאיים באמצעות הטכניקה המכונה microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA) מתוארים. סידן הוא Intramitochondrial דגש מיוחד בגלל התפקיד הקריטי שעומס יתר סידן המיטוכונדריה משחק במחלות ניווניות. השיטה מבוססת על הניתוח של קרני ה-X שנוצר במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על ידי אינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם הדגימה. על מנת לשמור על הפצת יליד אלמנטי diffusible בדגימות מיקרוסקופית אלקטרונים, EPMA דורשת "cryofixation" של רקמה אחרי הכנת cryosections Ultrathin. הקפאה מהירה של תאים בתרבית או תרבויות הפרוסה organotypic מתבצעת על ידי הצעד ההקפאה באתאן הנוזלי או על ידי הקפאת טריקה נגד גוש מתכת קר, בהתאמה. Cryosections נומינלי 80 ננומטר העבה נחתכים יבש עם סכין יהלום בCA. -16076, C, רכוב על פחם / רשתות נחושת מצופה pioloform, וcryotransferred לcryo-EM באמצעות בעל cryospecimen מיוחד. לאחר סקר חזותי ומיפוי מיקום ב≤ -160 מעלות צלזיוס ומינון אלקטרונים נמוכים, cryosections קפוא התייבשות הם ב-100 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 דקות מיובשים בהקפאה. תמונות ברמת אברון של cryosections המיובש נרשמות, גם במינון נמוך, באמצעות מצלמת CCD איטית סריקה ואזורי subcellular של העניין נבחר לניתוח. קרני ה-X הנפלטת מROIs ידי ממוקדת, אלקטרון בדיקה נייחת, בעוצמה גבוהה נאספות על ידי רנטגן באנרגיה נפיצה ספקטרומטר (edx), מעובד על ידי האלקטרוניקה קשורה, ומוצג כספקטרום ה-X, כלומר, עלילה של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. תוכנה נוספות מאפשרת: 1) זיהוי של מרכיבים יסודיים על ידי האנרגיות שלהם "האופייניות" לשיא וטביעת אצבע; ו2) ניתוח כמוני על ידי מיצוי של אזורי שיא / רקע. מאמר זה מסכם בשתי דוגמאות הממחישות טיפוסייישומי EPMA, אחד שבו ניתוח סידן המיטוכונדריה סיפק תובנה קריטית לתוך מנגנונים של פגיעת יתר רעילה ועוד, שחשפו את הבסיס של התנגדות איסכמיה.
Introduction
יוני סידן הוא ללא ספק ישות תא איתות החשובה והמגוונים ביותר בביולוגיה, ששיחק תפקיד חיוני בתהליכים נורמלים מגוון כמו שידור סינפטי וביטוי גנים. מצד השני, סידן חשוב באותה מידה במוות של תאים. בפרט, הסרת הפיקוח סידן הוא גורם מפתח בפגיעה עצבית בשבץ מוחי, פרקינסון, אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות 3,5. לכן, חשוב באופן קריטי להבנת כמותית כמה סידן מופץ בתוך תאים, ואיך זה משתנה בעקבות גירויים פיסיולוגיים או pathophysiological. מטרה זו היא מסובכת בשל העובדה כי סידן מופץ באופן דינמי בין שתי מדינות פיזיות – חופשיות בפתרון או קשורה למצע – וכי ריכוזי סידן תאי לשנות פני כמה סדרי הגודל כתוצאה מגירוי.
אמנם יש מספר שיטות מתקדמות זמינות עבור הניתוח של free סידן תוך תאי, קביעת ריכוזי סידן הכולל בתאים תאיים מוגדרים מוגבלת באופן מציאותי לגישה אחת, כלומר, microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA). EPMA היא טכניקה שזוגות ספקטרומטר X-ray למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). תותח האלקטרונים TEM מתמקד אלקטרון בדיקה נייחת, submicron באזור subcellular של ריבית וקרן ה-X האלמנט ספציפי הנפלטת כתוצאה מהפגזת אלקטרונים שנאספו ונותח (ראה אזכור 7, 4 לביקורות טכניות מפורטות). יתרונותיו של EPMA כוללים רזולוציה ברמת אברון אחת ורגישות submillimolar. בפועל, עם זאת, דורשת EPMA cryotechniques מיוחד ומכשור להכנת דגימה וניתוח. הנה, את הכלים, הטכניקות והמכשירים מתאימים למידות של סידן תוך שימוש בEPMA מתוארות. סידן הוא Intramitochondrial של i המיוחדתnterest על חשבון התפקיד הקריטי שמחזות עומס יתר סידן המיטוכונדריה במחלות ניווניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת האלקטרונים המבוסס על מיקרוסקופ האנליטיות שהוצגה כאן מאפשרת לגילוי, זיהוי והכימות של כמה אלמנטים של עניין ביולוגי, כוללים Na, K, P, ובמיוחד Ca. ניתן לבצע ניתוחים אלה יצאו בsubcellular, כלומר, תוך אברון, רזולוציה בשל היכולת לאתר ולזהות מבנים של עניין בתמונות באיכות גבו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לגב 'כריסטין א ינטרס לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי התכנית למדעי המוח הבסיסית של תכנית NINDS המחקר העירונית, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
