Summary

Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

Published: November 20, 2013
doi:

Summary

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Abstract

En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere "criofijación" de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus "características" energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.

Introduction

Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas 3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este objetivo se complica por el hecho de que el calcio se distribuye dinámicamente entre los dos estados físicos – libre en solución o unido a un sustrato – y que las concentraciones de calcio celular cambian a lo largo de varios órdenes de magnitud, como consecuencia de la estimulación.

Si bien existen varias metodologías avanzadas disponibles para el análisis de free de calcio intracelular, la determinación de las concentraciones de calcio total en compartimentos intracelulares definidos se limita de manera realista a un enfoque, a saber, microanálisis de sonda de electrones (EPMA). EPMA es una técnica que las parejas un espectrómetro de rayos X para un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El cañón de electrones TEM se centra una sonda electrónica submicras estacionaria en una región subcelular de interés y los rayos X de elementos específicos emitidos como resultado del bombardeo de electrones son recogidos y analizados (ver referencias 7, 4 para revisiones técnicas detalladas). Ventajas de EPMA incluyen sola resolución a nivel de orgánulo y sensibilidad submilimolar. En la práctica, sin embargo, requiere EPMA cryotechniques e instrumentos especializados para la preparación y análisis de muestras. Aquí se describen las herramientas, técnicas e instrumentos adecuados para la medición de calcio intracelular usando EPMA. Calcio intramitocondrial es de i especiall interés en cuenta el papel fundamental que desempeña la sobrecarga de calcio mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas.

Protocol

El método descrito aquí se ha desarrollado utilizando instrumentos específicos, herramientas y software. Debido a que los laboratorios no va a utilizar la misma configuración experimental del enfoque es generalizado en lo posible. 1. Congelación Rápida El método analítico que se describe es absolutamente dependiente de enfoques criogénicos para: 1) el "criofijación" de las células o tejidos de una manera que preserva cuantitativamente la distri…

Representative Results

Las células del cerebro típicamente sufrir una lesión excitotóxica como resultado de la liberación de neurotransmisores patológico que se produce en condiciones isquémicas. EPMA fue fundamental para descubrir cómo la capacidad de las mitocondrias neuronales para secuestrar grandes cantidades de calcio subyace al mecanismo de la lesión. La micrografía de electrones en la Figura 3 ilustra la apariencia de las mitocondrias en criosecciones liofilizados de las neuronas del hipocampo en cultivo con…

Discussion

El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Christine A. Winters por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural NINDS, NIH (Z01 NS002610).

Materials

REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips Thermo Fischer Scientific 72280
Culture inserts BD Falcon 353090 For 6-well plates
Cryopins Leica Microsystems 16701952 Grooved
Wood applicators EM Sciences 72300
Folding EM grids Ted Pella 4GC100/100 100 mesh
Indium foil Alfa Aesar 13982 0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device Leica Microsystems KF-80
Slam freezing device LifeCell CF-100
Ultramicrotome Leica Microsystems UC6
Cryoattachment for microtome Leica Microsystems FC6
Diamond cryotrimming tool Diatome Cryotrim 45
Diamond cryoknife Diatome Cryo 35
Antistatic device Diatome Hauf Static Line
Cryo electron microscope Carl Zeiss Microscopy EM912 Omega
EM cryo specimen holder Gatan CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k Troendle (TRS) Sharpeye
Image acquisition software Olympus SIS iTEM suite
ED x-ray detector Oxford Instruments Linksystem Pentafet
Pulse Processor Oxford Instruments XP-3
PCI backplane card 4pi Systems Spectral Engine II
Desktop computer Apple Any OS9-compatible model
X-ray analysis software NIST DTSA, DTSA II
Spreadsheet software Microsoft Excel
  1. The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.
  2. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4.
  3. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.
  4. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

References

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Cite This Article
Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (81), e50807, doi:10.3791/50807 (2013).

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