電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定
Summary
本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。
Abstract
この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。
Introduction
カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 – – 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。
FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、優れた技術支援のために氏クリスティーヌA.冬を感謝したいと思います。この作品は、NINDS学内研究プログラム、NIH（Z01 NS002610）の基本神経科学プログラムによってサポートされていました。
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
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References
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