इलेक्ट्रॉन जांच एक्स - रे Microanalysis द्वारा न्यूरॉन्स में कुल कैल्शियम का मापन

Summary

इस पत्र physiologically परिभाषित जैविक नमूनों में subcellular संकल्प में कुल कैल्शियम की मात्रा और वितरण की मात्रात्मक माप करने cryoanalytical इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन है.

Abstract

इस अनुच्छेद में इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) के रूप में जाना तकनीक का उपयोग उपकरण, तकनीक, और intracellular मौलिक सामग्री का मात्रात्मक मापन के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम क्योंकि mitochondrial कैल्शियम अधिभार neurodegenerative रोगों में खेलता है कि महत्वपूर्ण भूमिका की एक विशेष ध्यान है. विधि एक्स – रे का विश्लेषण नमूना के साथ एक इलेक्ट्रॉन बीम की बातचीत से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में उत्पन्न पर आधारित है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूनों में प्रसारण तत्वों के मूल निवासी वितरण बनाए रखने के लिए, EPMA ultrathin cryosections की तैयारी द्वारा पीछा ऊतक की "cryofixation" की आवश्यकता है. संवर्धित कोशिकाओं या organotypic टुकड़ा संस्कृतियों का तेजी से ठंड क्रमश: एक ठंडी धातु ब्लॉक के खिलाफ तरल एटैन में या स्लैम ठंड के कारण जमने डुबकी द्वारा किया जाता है. Cryosections नाममात्र मोटी 80 एनएम सीए में एक हीरा चाकू के साथ सूखी काट रहे हैं. -16076, सी, कार्बन / pioloform लेपित तांबे ग्रिड पर मुहिम शुरू की है, और एक विशेष cryospecimen धारक का उपयोग कर एक क्रायो ईएम में cryotransferred. सी और कम इलेक्ट्रॉन खुराक ° ≤ -160 पर दृश्य सर्वेक्षण और स्थान मानचित्रण के बाद, जमे हुए हाइड्रेटेड cryosections फ्रीज सूखे ~ 30 मिनट के लिए -100 डिग्री सेल्सियस पर हैं. सूखे cryosections की organelle स्तर छवियों को एक धीमी गति से स्कैन सीसीडी कैमरा और विश्लेषण के लिए चयनित हित के subcellular क्षेत्रों के माध्यम से भी कम मात्रा में, दर्ज कर रहे हैं. एक स्थिर, ध्यान केंद्रित, उच्च तीव्रता इलेक्ट्रॉन जांच से ROIs से उत्सर्जित एक्स – रे एक ऊर्जा फैलानेवाला एक्स – रे (EDX) जुड़े इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा संसाधित स्पेक्ट्रोमीटर,, और एक एक्स – रे स्पेक्ट्रम के रूप में प्रस्तुत द्वारा एकत्र कर रहे हैं, वह है, एक ऊर्जा बनाम एक्स – रे तीव्रता की साजिश है. अतिरिक्त सॉफ्टवेयर की सुविधा: उनके "विशेषता" पीक ऊर्जा और फिंगरप्रिंट द्वारा मौलिक घटकों का 1) पहचान, और चोटी के क्षेत्रों / पृष्ठभूमि की निकासी के द्वारा 2) मात्रात्मक विश्लेषण. इस पत्र विशिष्ट उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि दो उदाहरणों के साथ समाप्तMitochondrial कैल्शियम विश्लेषण ischemia के प्रतिरोध के आधार से पता चला है कि excitotoxic चोट और एक अन्य के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, जिनमें से एक में EPMA अनुप्रयोगों,.

Introduction

कैल्शियम आयनों synaptic प्रसारण और जीन अभिव्यक्ति के रूप में विविध रूप में सामान्य प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभा रहा है, यकीनन जीव विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण और बहुमुखी संकेतन सेल इकाई हैं. दूसरी ओर, कैल्शियम कोशिका मृत्यु में भी उतना ही महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, कैल्शियम ढील स्ट्रोक में neuronal चोट में एक महत्वपूर्ण कारक है, पार्किंसंस, अल्जाइमर और अन्य neurodegenerative रोगों ^3,5. इस प्रकार, यह कैल्शियम कोशिकाओं के भीतर वितरित किया जाता है कैसे मात्रात्मक समझने के लिए महत्वपूर्ण है, और कैसे यह शारीरिक या pathophysiological उत्तेजनाओं निम्न परिवर्तन. समाधान में नि: शुल्क या एक सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य – – और सेलुलर कैल्शियम की सांद्रता उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में परिमाण के कई आदेशों के साथ बदल कि इस लक्ष्य को कैल्शियम गतिशील रूप से दो शारीरिक राज्यों के बीच वितरित किया जाता है कि इस तथ्य से जटिल है.

Fr के विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई उन्नत तरीके जबकि वहाँintracellular कैल्शियम EE, परिभाषित intracellular डिब्बों में कुल कैल्शियम की सांद्रता का दृढ़ संकल्प वास्तविक एक दृष्टिकोण, अर्थात्, इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) तक सीमित है. EPMA कि जोड़े एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) के लिए एक एक्स – रे स्पेक्ट्रोमीटर एक तकनीक है. मंदिर इलेक्ट्रॉन बंदूक ब्याज और इलेक्ट्रॉन बमबारी का एक परिणाम के रूप में उत्सर्जित तत्व विशेष एक्स – रे की एक subcellular क्षेत्र पर एक स्थिर, submicron इलेक्ट्रॉन जांच केंद्रित (विस्तृत तकनीकी समीक्षा के लिए संदर्भ ^{7, 4} देखें) एकत्र की है और विश्लेषण कर रहे हैं. EPMA के लाभ एकल organelle स्तर के संकल्प और submillimolar संवेदनशीलता शामिल हैं. अभ्यास में, तथापि, EPMA नमूना तैयार करने और विश्लेषण के लिए विशेष cryotechniques और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है. इधर, उपकरण, तकनीक और EPMA का उपयोग intracellular कैल्शियम की माप के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम विशेष मैं का हैमहत्वपूर्ण भूमिका के कारण nterest कि neurodegenerative रोगों में mitochondrial कैल्शियम अधिभार नाटकों.

Protocol

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण विशिष्ट उपकरणों, उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकसित किया गया था. प्रयोगशालाओं में एक ही प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग नहीं होगा, क्योंकि दृष्टिकोण जहां संभव सामान्यीकृत है. <p cla…

Representative Results

मस्तिष्क कोशिकाओं को आमतौर पर इस्कीमिक स्थितियों के कारण होती है कि रोग neurotransmitter रिहाई का एक परिणाम के रूप में excitotoxic चोट बनाए. EPMA कैल्शियम की भारी मात्रा में पृथक neuronal mitochondria की क्षमता चोट के तंत्र का आधार कैसे …

Discussion

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप आधारित विश्लेषणात्मक विधि यहाँ प्रस्तुत पहचान का पता लगाने, और ना, कश्मीर, पी, और विशेष रूप से सीए सहित जैविक हित के कई तत्वों के quantitation के लिए अनुमति देता है. ये विश्लेषण, subcellular पर ब…

Materials

			REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
			EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
			The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)