De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek
Summary
Hier hebben we detail een methode om cultuur tand ziektekiemen in onderkaak plakjes met een tissue chopper. Deze methode maakt het mogelijk unieke toegang tot de tand tijdens de ontwikkeling, het verstrekken van uitstekende gelegenheid voor manipulatie en lineage tracing, niet beschikbaar gebruik van meer traditionele kweekmethoden.
Abstract
Explantaatkweek staat manipulatie van het ontwikkelen van organen op specifieke tijdstippen en is daarom een belangrijke methode voor het ontwikkelings bioloog. Voor veel organen is moeilijk toegankelijk ontwikkeling weefsel controle tijdens het ex vivo kweken mogelijk. De slice cultuur methode maakt het mogelijk de toegang tot weefsel zodat morfogenetische bewegingen kunnen worden gevolgd en specifieke celpopulaties kan worden gericht voor manipulatie of lineage tracing.
In dit artikel beschrijven we een methode slice cultuur die zeer succesvol voor de cultuur van de tand ziektekiemen in een aantal soorten is geweest. De methode biedt een uitstekende toegang tot de tand kiemen, die zich ontwikkelen met een vergelijkbaar percentage met dat waargenomen in vivo, omringd door de andere kaak weefsels. Dit maakt weefsel interacties tussen de tand en het omringende weefsel te controleren. Hoewel dit document richt zich op de tanden kiemen kan hetzelfde protocol worden toegepast om de ontwikkeling van een doorlooptandere organen, zoals speekselklieren, Meckel's kraakbeen, nasale klieren, tong en oren.
Introduction
Bij een aantal experimenten is het belangrijk om te kunnen cultuur weefsel ex vivo ontwikkeling te volgen. Cultuur ontwikkelen weefsel worden bereikt in bepaalde perioden van ontwikkeling en staat manipulatie van genen door de toevoeging van elementen aan het kweekmedium, of beladen kralen, en door middel van transfectie en elektroporatie 1. Voor veel experimenten is het belangrijk om het weefsel te visualiseren als het groeit, bijvoorbeeld om het lot van afstammings gemerkte cellen volgen het weefsel ondergaat morfogenese. Dit kan bijzonder problematisch zijn voor weefsels die diep in het embryo ontwikkelt, die niet duidelijk wanneer een blok van weefsel van het embryo gekweekt. Tanden zijn goede voorbeelden van deze, als ze zich ontwikkelen in de onderkaak, bovenkaak en frontaal nasale proces. Wanneer de gehele onderkaak wordt gekweekt de oppervlakkige structuren van de tand kan worden bekeken, maar veranderingen in morfologie kunnen alleen worden geanalyseerd na het snijden van vaste weefsels <sup> 2. We hebben een live-slice cultuur techniek waardoor we tandkiem ontwikkeling te volgen en het verschaffen van toegang tot de verschillende delen van de tand tijdens de ontwikkeling aangepast. De techniek culturen de tandkiem plakjes op de gas-vloeistof-interface, met behulp van een gemodificeerde Trowell methode 3. Deze slice culturen zijn zeer nuttig direct na morfogenese van de tand, en waarbij geslacht traceren van afzonderlijke onderdelen, zoals het glazuur knoop en dentale papil en follikel 1,4-7. De techniek is niet beperkt tot muizenembryo's en met succes gebruikt om levende cultuur plakjes varkens en slang tandweefsel 8,9. Naast het voordeel van de mogelijkheid om tandontwikkeling visualiseren, de plak werkwijze heeft ook het voordeel dat de dunne plakjes weefsel van het medium en lucht uit de incubator toegang tot voedingsstoffen toegenomen. Dit resulteert in een betere groei van de tand kiemen, die de ontwikkeling passen in vivo, en tonen Invasion van endotheelcellen in de papil 7. Daarentegen tand kiemen geheel onderkaak culturen ontwikkelen langzamer dan in vivo en het midden van de kweek vaak necrotisch langdurige culturen. In slice cultuur, de tand ontwikkelt in een deel van de kaak, en zijn interactie met de omringende ontwikkelen bot en ander weefsel kunnen worden bewaakt. In onze werkwijze het weefsel gesneden meteen na dissectie zonder de noodzaak voor inbedding in een dragermedium 10,11 en geen behoefte aan een systeem om het weefsel hechten aan het hakblok. De methode is daarom niet-invasieve en snel, waardoor vele onderkaken worden doorgesneden in een sessie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode van tand cultuur heeft het voordeel dat de toegang tot de tandkiem uitstekend, waardoor nauwkeurige lineage tracing en plaatsing van parels in het epitheel of de mesenchym. Gedefinieerde gebieden van de ontwikkeling van tandkiem kan dus specifiek worden gericht. Tijdens kweek de veranderende morfologie van de tandkiem te volgen, en het effect van manipulaties snel beoordeeld.
De werkwijze is echter alleen geschikt voor kleine tand kiemen voor aanzienlijke vorming van harde weefs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sarah A. Alfaqeeh wordt gefinancierd door Kind Saud University College of Dentistry, ministerie van Hoger Onderwijs, Koninkrijk Saoedi-Arabië.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Invitrogen | |||
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Invitrogen | |||
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig’s epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
