Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura
Summary
Qui ci dettaglio un metodo per cultura germi denti in fette mandibola con un chopper tessuto. Questo metodo consente l'accesso esclusivo al dente durante lo sviluppo, fornendo un'ottima opportunità per la manipolazione e lignaggio tracing, non disponibile utilizzando metodi di coltura più tradizionali.
Abstract
Cultura espianto permette la manipolazione di sviluppare organi in punti temporali specifici ed è quindi un metodo importante per il biologo dello sviluppo. Per molti organi è difficile accedere tessuto sviluppo per consentire il controllo nelle ex vivo cultura. Il metodo di coltura fetta permette l'accesso al tessuto in modo che i movimenti morfogenetici possono essere seguiti e specifiche popolazioni cellulari possono essere oggetto di manipolazione o lineage tracing.
In questo articolo descriviamo un metodo di cultura fetta che ha avuto molto successo per la cultura di germi denti in una vasta gamma di specie. Il metodo fornisce un eccellente accesso ai germi dei denti, che si sviluppano a un ritmo simile a quello osservato in vivo, circondato da altri tessuti della mascella. Questo permette interazioni tessuto tra il dente e del tessuto circostante da monitorare. Sebbene questo documento si concentra sulla germi dei denti, lo stesso protocollo può essere applicato a seguire lo sviluppo di un numerodi altri organi, come ad esempio le ghiandole salivari, cartilagine di Meckel, ghiandole nasali, lingua e orecchie.
Introduction
Per una serie di esperimenti è importante essere in grado di coltura di tessuti ex vivo per seguire lo sviluppo. Cultura di sviluppo del tessuto fornisce l'accesso a determinati periodi di sviluppo e permette la manipolazione dei geni con l'aggiunta di fattori al terreno di coltura, o microsfere caricate, e con l'uso di trasfezione e elettroporazione 1. Per molti esperimenti è importante essere in grado di visualizzare il tessuto come cresce, per esempio, per seguire il destino di cellule della linea etichettato come il tessuto subisce morfogenesi. Questo può essere particolarmente problematico per i tessuti che si sviluppano in profondità all'interno dell'embrione, che non sono evidenti quando un blocco di tessuto dall'embrione è coltivato. I denti sono buoni esempi di questo, come si sviluppano all'interno del processo nasale della mandibola, mascellare e frontale. Quando tutta la mandibola viene coltivato le strutture superficiali del dente possono essere visualizzati ma cambiamenti nella morfologia possono essere analizzati solo dopo il sezionamento di tessuto fissato <sup> 2. Abbiamo adattato una fetta tecnica di coltura in diretta che ci permette di seguire dente sviluppo germe e l'accesso alle varie parti del dente durante lo sviluppo. Le culture tecnica le fette dente germinali all'interfaccia gas-liquido, usando un metodo Trowell modificato 3. Queste culture fetta sono state molto utili nelle seguenti direttamente morfogenesi del dente, e permettendo lineage tracing di componenti distinti, quali il nodo smalto e la papilla dentale e follicolo 1,4-7. La tecnica non è limitata agli embrioni di topo ed è stato usato con successo per coltura fette diretta di maiale e serpente 8,9 tessuto dentale. Oltre al vantaggio di essere in grado di visualizzare lo sviluppo dei denti, il metodo slice ha anche il vantaggio che le fettine di tessuto sono aumentati accesso ai nutrienti dal mezzo e aria dall'incubatore. Ciò si traduce in un miglioramento della crescita dei germi dei denti, che corrispondono sviluppo in vivo e spettacoli invasione delle cellule endoteliali nella papilla 7. Al contrario, germi da denti in intere culture mandibola sviluppano più lenti di quelli in vivo e il centro della cultura è spesso necrotico in colture a lungo termine. Nella cultura fetta, il dente si sviluppa all'interno di una fetta della mandibola, e la sua interazione con l'osso circostante e sviluppare altri tessuti può essere monitorato. Nel nostro metodo il tessuto viene tagliato subito dopo dissezione senza necessità di incorporare in un mezzo di supporto 10,11 e non necessita di alcun sistema per attaccare il tessuto per il taglio di blocco. Il metodo è quindi non invasivo e rapido, consentendo molti mandibole da sezionare in una sessione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo di coltura dente ha il vantaggio che l'accesso al germe dente è eccellente, consentendo lignaggio accurato tracciamento e posizionamento di perline all'interno dell'epitelio o mesenchima. Regioni definite del dente di sviluppo germe possono quindi essere specificamente mirati. Durante la coltura morfologia mutevole del germe dente può essere seguito, e l'effetto di manipolazioni valutato rapidamente.
Il metodo, tuttavia, è adatto solo per giovani germi dente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sarah A. Alfaqeeh è finanziato dal tipo Saud University College of Dentistry, Ministero dell'Istruzione Superiore, Regno dell'Arabia Saudita.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Invitrogen | |||
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Invitrogen | |||
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
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