Кусочек Культура Метод После Развитие Зуб микробов в эксплантата культуры
Summary
Здесь мы подробно метод культуры зубных микробов в нижней челюсти ломтиками использованием тканей вертолет. Этот метод позволяет уникальный доступ к зуба в процессе разработки, обеспечивая прекрасную возможность для манипуляций и рода трассировки, не доступен, используя более традиционные методы культивирования.
Abstract
Эксплантата культура позволяет манипулирование разработке органы в определенные моменты времени и, следовательно, является важным методом для биолога развития. Для многих органов трудно получить доступ к развивающимся ткани, чтобы позволить мониторинг во время экс естественных условиях культуры. Метод ломтик культура позволяет получить доступ к ткани, так что морфогенетические движения можно проследить и конкретные клеточные популяции могут быть направлены для манипуляции или клонов трассировки.
В этой статье мы опишем метод среза культуры, который был очень успешным для культуры зубных микробов в диапазоне видов. Метод обеспечивает удобный доступ к зубу микробов, которые развиваются с такой же скоростью, наблюдаемой в естественных условиях, в окружении других челюстных тканей. Это позволяет взаимодействия между тканей зуба и окружающих тканей, подлежащих мониторингу. Хотя эта статья концентрируется на микробов зубов, и тот же протокол может применяться следовать развитие рядадругих органов, таких как слюнные железы, хрящей Меккелев, носовых желез, языка, и ухо.
Introduction
Для ряда экспериментов важно, чтобы иметь возможность культуры ткани экс естественных условиях, чтобы следить за развитием. Культура разработке ткани обеспечивает доступ через определенные периоды развития и позволяет манипуляции генов путем добавления факторов в культуральной среде, или на загружалась бисера, и с помощью трансфекции и электропорации 1. Для многих экспериментов важно иметь возможность визуализировать ткани, как он растет, например, следовать судьбу меченых клеток клона как ткань подвергается морфогенез. Это может быть особенно проблематичным для тканей, которые развиваются в глубине эмбриона, которые не являются очевидными, когда блок ткани из эмбриона культивируют. Зубы являются хорошими примерами того, как они развиваются в рамках процесса носа нижней челюсти, верхней и фронтальной. Когда вся челюсть культивируют поверхностные структуры зуба можно просматривать, но изменения в морфологии могут быть проанализированы только после срезов фиксированной ткани <sдо> 2. Мы адаптировали живой технику культуры ломтик позволяет нам следить за развитием зубов зародышей и обеспечивает доступ к различным частям зуба в процессе разработки. Методика культур ломтики зубного зачатка на границе газ-жидкость, используя модифицированный метод Trowell 3. Эти срез культуры были очень полезны в непосредственно следующий морфогенез зуба, и позволяет клонов отслеживание отдельных компонентов, таких как эмали узлом и зубной сосочек и фолликул 1,4-7. Методика не ограничивается мышиных эмбрионов и успешно использовались для культивирования живых ломтиками свиньи и змеи зубной ткани 8,9. В дополнение к преимуществу, которое позволяет визуализировать развития зубов, способ ломтик также имеет то преимущество, что тонкие ломтики ткани имеют увеличенный доступ к питательных веществ из среды и воздуха из инкубатора. Это приводит к улучшению роста зубов микробов, которые соответствуют развитию в естественных условиях, и шоу INVASион эндотелиальных клеток в сосочка 7. В отличие от этого, зубные зачатки в целых челюсти культур прогрессируют медленнее, чем в естественных условиях и центром культуры часто некротических в долгосрочных культур. В среза культуры, зуб развивается в течение кусочком челюсти, и его взаимодействие с окружающим развивающихся костей и других тканей можно контролировать. В нашем методе ткань нарезанный сразу после вскрытия без необходимости вставлять в опорной среде 10,11 и без потребности в какой-либо системе, чтобы приложить ткань к плаху. Поэтому способ неинвазивным и быстрым, что позволяет многим челюсти быть секционного за один сеанс.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод культуры зуба имеет то преимущество, что доступ к зубного зачатка отлично, позволяя точное происхождение отслеживание и размещение бисера в эпителии или мезенхимы. Определенные регионы развивающегося зубного зачатка, следовательно, может быть конкретно направлены. Во куль…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Сара А. Alfaqeeh финансируется Kind Сауда университета Колледж стоматологии, Министерства высшего образования, Королевства Саудовская Аравия.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Invitrogen | |||
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Invitrogen | |||
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig’s epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
