פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות
Summary
כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.
Abstract
תרבות explant מאפשרת מניפולציה של פיתוח איברים בנקודות זמן ספציפי ולכן שיטה חשובה לביולוג התפתחותי. לאיברים רבים שקשה לגשת לפיתוח רקמות על מנת לאפשר ניטור בזמן vivo התרבות לשעבר. שיטת התרבות הפרוסה מאפשרת גישה לרקמה, כך שיכולות להיות אחרי תנועות morphogenetic ואוכלוסיות תאים ספציפיות יכולות להיות ממוקדות עבור מניפולציה או התחקות שושלת.
במאמר זה אנו מתארים שיטה של התרבות הפרוסה שהייתה מוצלח מאוד לתרבות של חיידקי שן במגוון מינים. השיטה מספקת גישה מצוינת לחיידקי השן, אשר לפתח בקצב דומה לזה שנצפה בvivo, מוקף ברקמות לסת האחרות. זה מאפשר אינטראקציות רקמות בין השן והרקמה שמסביב כדי להיות במעקב. למרות שמאמר זה מתמקד בחיידקי שן, באותו הפרוטוקול ניתן ליישם כדי לעקוב אחר התפתחותם של מספרשל איברים אחרים, כגון בלוטות רוק, סחוס של מקל, בלוטות באף, בלשון, ובאוזן.
Introduction
עבור מספר הניסויים חשוב להיות מסוגלים רקמות תרבות vivo לשעבר לעקוב אחר התפתחות. תרבות של פיתוח רקמה מספקת גישה בתקופות מוגדרות של פיתוח ומאפשרת מניפולציה של גנים על ידי התוספת של גורמים למדיום התרבות, או בחרוזים טעונים, ועל ידי השימוש בtransfection electroporation ו1. בניסויים רבים, חשוב להיות מסוגל לדמיין את הרקמה ככל שהוא גדל, לדוגמא, כדי לעקוב אחר גורלם של תאי שושלת מתויגת כרקמה עוברת המורפוגנזה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד לרקמות המתפתחות עמוק בתוך העובר, שאינן ברורים כאשר בלוק של רקמות מן העובר הוא תרבותי. שיניים הן דוגמאות טובות לכך, כפי שהם מפתחים בתוך תהליך האף הלסת התחתונה, הלסת העליונה וקדמי. כאשר כל הלסת התחתונה היא בתרבית ניתן לראות המבנים השטחיים של השן אך ניתן לנתח שינויים במורפולוגיה רק לאחר חתך של רקמה קבועה <sעד> 2. יש לנו להתאים טכניקת תרבות פרוסה חיות ומאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות חיידקים בשיניים ובמתן גישה לחלקים השונים של השן במהלך פיתוח. תרבויות טכניקת פרוסות נבט שן בממשק גז הנוזלי, באמצעות שיטת Trowell שונה 3. תרבויות הפרוסה אלה היו מאוד שימושיות באופן ישיר הבא המורפוגנזה של השן, ומאפשר איתור שושלת של רכיבים שונים, כגון קשר האמייל ואת הגבשושיות וזקיק 1,4-7 שיניים. הטכניקה אינה מוגבלת לעוברי עכברים והצלחה כבר בשימוש לפרוסות תרבות חיות של חזיר ו8,9 רקמות שיניים נחש. בנוסף ליתרון של להיות מסוגל לדמיין התפתחות שן, שיטת פרוסה גם יש את היתרון שהפרוסות הדקיקות של רקמה הגדילו את הגישה לחומרים מזינים מבינונית ואוויר מהחממה. התוצאה היא צמיחה משופרת של חיידקי השן, אשר תואם את פיתוח in vivo, וinvas המופעיון של תאי האנדותל לפטמית 7. לעומת זאת, חיידקי שן בתרבויות לסת תחתונה כולו לפתח איטיים יותר מאלה in vivo ומרכז התרבות הוא לעתים קרובות נמקים בתרבויות לטווח ארוך. בתרבות הפרוסה, השן מתפתחת בתוך פרוסה של הלסת, והאינטראקציה שלה עם העצם מתפתח סביב ורקמות אחרות יכולה להיות במעקב. בשיטה שלנו הרקמה קצוצה ישר אחרי נתיחה ללא צורך להטביע במדיום תמיכת 10,11 ואין צורך בכל מערכת לצרף את הרקמה לקרש החיתוך. השיטה היא לכן לא פולשנית ומהירה, המאפשרת ללסתות רבות להיות מחולקים בפגישה אחת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו של תרבות שן יש את היתרון שהגישה לניבט השן הוא מצוין, המאפשר ייחוס מדויק באיתור מיקום של חרוזים בתוך האפיתל או mesenchyme. באזורים מוגדרים של נבט השן המתפתח יכולים להיות ממוקדים ולכן באופן ספציפי. במהלך תרבות המורפולוגיה המשתנות של נבט השן יכולה להיות אחריו, ואת ההש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
שרה א Alfaqeeh ממומן על ידי Kind סעוד מכללת אוניברסיטה לרפואת שיניים, משרד להשכלה גבוהה, ממלכת ערב הסעודית.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Invitrogen | |||
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Invitrogen | |||
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
- Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
- Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
- Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
- Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
- Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
- Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
- Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
- Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig’s epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. , (2012).
- Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
- Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
- Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
- Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
