이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

요약

여기에 디테일이 조직 헬기를 이용하여 하악 조각 문화 치아 세균에 방법을 우리는. 이 방법은 전통적인 배양 방법을 사용하여 사용 가능한 조작과 혈통 추적하지를위한 절호의 기회를 제공하고, 개발하는 동안 치아에 고유 한 액세스 할 수 있습니다.

초록

이식편의 문화는 특정 시점에서 장기를 개발하고 조작 따라서 발달 생물학을위한 중요한 방법입니다 수 있습니다. 많은 기관의 경우는 체외 배양시 모니터링 할 수 있도록 개발 조직에 접근하기가 어렵습니다. 슬라이스 문화 방법은 수 있습니다 조직에 액세스 할 수 있도록 형태 형성의 움직임이 따라 할 수있는 특정 세포 집단이 조작 또는 계보 추적 대상이 될 수있다.

본 논문에서 우리는 종의 범위에서 치아 세균의 문화에 매우 성공적이었다 슬라이스 문화의 방법을 설명합니다. 방법은 다른 턱 조직으로 둘러싸인 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 비율로 개발 치아 세균에 우수한 액세스를 제공한다. 이것은 치아와 주위 조직 사이의 조직 상호 작용을 모니터링 할 수있다. 이 논문은 치아 세균에 집중되지만, 동일한 프로토콜이 수의 개발을 수행하도록 적용될 수있다이러한 침샘, 메켈의 연골, 코 분비, 혀, 귀 등 다른 장기의.

서론

실험의 번호는 문화 조직 생체 개발을 따르도록하는 것이 중요합니다. 조직 개발 농경 개발의 정의 기간에 액세스를 제공하고, 배양 배지에 요소를 첨가하여 유전자의 조작, 또는로드 구슬 및 형질 및 일렉트로 ^하나의 사용에 의해 허용한다. 많은 실험을 위해 그것이 성장함 조직 형태 형성을 겪는다로서 혈통 표지화 된 세포의 운명을 따라, 예를 들어, 조직을 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 이 배아에서 조직의 블록을 배양 할 때 분명하지 않은 깊은 배아 내 개발 조직에 특히 문제가 될 수 있습니다. 그들은 하악, 상악과 정면 코 프로세스 내에서 개발로 이빨이 좋은 예입니다. 전체 하악이 배양되면 고정 된 조직으로 구획 한 후, 치아의 표면 구조는 볼 수 있지만, 형태 변화만을 분석 할 수있다 2. 우리는 우리가 치아 세균의 개발을 수행 할 수 있도록 개발 중에 치아의 다른 부분에 대한 액세스를 제공하는 라이브 슬라이스 문화 기술을 적용했다. Trowell에서 변성 방법 ^3을 사용하여 기체 - 액체 계면에서 기술 배양 치아 세균 조각. 이러한 슬라이스 문화를 직접 치아의 형태 형성을 다음과 같은 에나멜 매듭 치과 유두와 여포 ^1,4-7과 같은 별개의 구성 요소의 혈통 추적을 수있는 매우 유용하고있다. 기술은 마우스 ....

프로토콜

1. 설정

1. (미네랄 오일로 윤활 숫돌을 사용하여) 해부 도구를 선명하게 및 70 % 에탄올 스프레이 건조 가열 살균을 사용하는 기관 배양을 위해 사용하기 전에 소독. 12 V 공급 장치를 사용하여 2 M 수산화 나트륨을 사용하여 전기 분해 해부 바늘을 선명.
2. 1 % 루타와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충 고급 둘 베코의 수정 이글 중간 F12 (DMEM의 F12)으로 구성된 배아 기관의 해부와 문화에 사용되는 배지를 준비합니다.

2. 배아 해부

1. 홈 오피스 또는 기타 관리위원회가 승인 한 일정 하나의 방법을 사용하여 일정 시간 성관계 임신 여성을 추려. 낮은 복부 주위의 피부를 멀리 해부 가위를 사용하여 복부를 열 컷. 낮은 중간 선에 함께 연결하는 두 개의 자궁 뿔을 찾습니다.
2. 얼음 매체로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 갔지N 얼음에, 조직은 몇 시간 동안 남아있을 수 있습니다.
3. 현미경으로 중간에있는 페트리 접시에있는 자궁과 장소를 제거합니다. 가능한 배아 해부 오염을 최소화하기 위해 층류 흐름 후드에서 수행되어야하는 위치.
4. 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서....

결과

제 어금니 치과 여포의 움직임에 추종하기 위하여, 250 μM 정면 슬라이스는 상기 한 방법을 사용하여 하악 통해 촬영했다. 치아 뿌리는 개발 치아의 바깥 쪽 에나멜 상피 (OEE)을 둘러싸는 중간 엽의 층이며, 이전에 치주 ^6의 조직의 형성에 참여하는 것으로 나타났다. 턱은 E14.5, 치아 개발의 캡 단계에서 해부했다. 슬라이스 내의 치과 상피의 윤곽이 맑아 응축 치과 간엽은 치아 상피 세포 (도 4a)의 주위에 어두운 링으로서 식별 될 수있다. DII는 설측 (그림 4A)에 치아 조각의 외부 에나멜 상피 옆에있는 중간 엽에 주입 하였다. 라벨 후 조각은 4 일 동안 배양 및 간격 (그림 4B 및 4C)에서 촬영. 생체 치아 세균에 도달 할 것E18.5 바이 벨 스테이지와 별개 종 단 형상은이 기간 동안 유사한 진행을 나타내는 슬라이스에서 관찰되었다. DII의 자리는 .......

토론

치아 배양이 방법은 치아의 세균에 대한 액세스 장점은 정확한 계보가 상피 세포 또는 중간 엽에서 추적 및 구슬의 배치를 허용, 우수한 있습니다. 개발 치아 세균의 정의 영역은 따라서 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다. 배양 중에 치아 세균의 변화 형태는 다음 될 수 있고, 조작의 효과는 빠르게 평가.

이 정확하게 다진 할 수있는 방법은, 그러나, 이러한 덴틴과 에나멜과 같은 단단한 조직의 실질적인 형성하기 전에 젊은 치아 세균에만 적합합니다. 턱의 경우 후 E15.5는 마 전에 뼈를 제거 할 필요가있다. 이것은 잠재적 밀접 E16.5에서 뼈와 관련된 치아 세균, 손상의 단점이있다. 우리는 성공적으로 치아로 인해 에나멜의 증착에 잘라 헬기 너무 어렵게되어 그 후, 생후 4 해부 치아의 세균을 분리했다. 슬라이스 Method는 꽃 봉오리 단계 ^1,6 즉, E13.5에서 치아 세균에 잘 작동합니다. 치아 상피 두껍게 단계에있을 때이 시간 지점 전.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에탄올	VWR	101077Y	100% 에탄올을 증류된 H2O에 70%까지 희석하였다.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (분자 프로브)	Vybrant	V-22885	세포 표지 용액
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( 분자 프로브)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	표준 테이블
장기 배양 접시 (Center-Well Organ Culture Dish)	팔콘	353037
막 (세포 배양 인서트, 0.4 μ m 기공 크기)	BD Falcon	353090	PET 트랙 에칭 멤브레인, 6웰 형식
금속 그리드(스테인리스강 - AISI 304 - 메쉬)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow 직접 가열 CO2 인큐베이터	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	단일 채널 picospritzer III
필라멘트가 있는 유리 모세관 1mm	WPI	TW100F-4
텅스텐 와이어 0.1mm	Goodfellow	W005138
텅스텐 와이어 0.38mm	Goodfellow	W005155
흡인기 튜브	Sigma	A5177	입 흡인 계통 추적기에 사용