Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus
Summary
Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.
Abstract
In diesem Protokoll wird ein Verfahren, um dendritische Zellen (DC) und Epithelzellen (TEC) von dem menschlichen Thymus isolieren. DC und TEC sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen (APC)-Typen in einem normalen Thymus gefunden, und es ist bekannt, dass sie unterschiedliche Rollen während Thymus-Auswahl zu spielen. Diese Zellen werden in unterschiedlichen Mikroumgebungen im Thymus lokalisiert und jeweils APC Typ macht nur einen geringen Population von Zellen. Die Biologie dieser Zelltypen weiter zu verstehen, ist die Charakterisierung dieser Zellpopulationen sehr wünschenswert, aber wegen ihrer niedrigen Frequenz, die Isolierung von jeder dieser Zelltypen erfordert ein effizientes und reproduzierbares Verfahren. Dieses Protokoll Details eine Methode für die Charakterisierung von verschiedenen zellulären Eigenschaften Zellen zu erhalten. Thymusgewebes mechanisch aufgeschlossen und nach verschiedenen Schritten des enzymatischen Verdau wird das erhaltene Zellsuspension mit einem Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte angereichert. Für die Isolierung von myeloischen DC (CD11c <sup> +)-Zellen von geringer Dichte Fraktion (LDF) durch magnetische Zellsortierung immunoselected. Anreicherung von TEC Populationen (mTEC, cTEC) durch Verarmung der hämatopoetischen (CD45 hallo)-Zellen von geringer Dichte Percoll Zellfraktion wodurch ihre anschließende Trennung mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung spezifischer Zellmarker erreicht. Für verschiedene Downstream-Anwendungen können die isolierten Zellen verwendet werden.
Introduction
Der Thymus ist das Organ, in dem T-Zell-Entwicklung auftritt. Seine relative und absolute Größe mit dem Alter abnimmt, wenn sie teil sukzessive durch Fett ersetzt, obwohl Thymusaktivität noch im Alter festgestellt werden. Seine Bedeutung für die Immunantwort wurde in den frühen 1960er Jahren ein demonstriert.
Die T-Zell-Repertoire ist durch die Wechselwirkung der T-Zell-Rezeptoren, die mit Peptid-MHC-Komplexe auf unterschiedliche Arten von Thymus-APC, die das Überleben oder Tod Signale zu entwickelnden T-Zellen, was zu einer funktionellen und weitgehend selbst tolerant T-Zell-Repertoire 2 vorzusehen geformt.
Etwa 98% der Zellen im menschlichen Thymus-T-Zellen entwickeln sich als Thymozyten bezeichnet. Die restlichen 2% bestehen aus einer Reihe von verschiedenen Zelltypen, einschließlich einer Vielzahl von TEC (kortikalen Mark, subkapsuläre), myeloide und plasmazytoiden DC (MDC, PDC), Makrophagen, B-Zellen reifen Umlauf-T-Zellen, Granulozyten, fibroblasts, Endothelzellen und Epithelzellen seltenen Zellen mit einem Expressions Phänotyp ähnlich derjenigen Zellen aus anderen Geweben, wie Muskel, Nervenzellen und respiratorischen Epithels (Abbildung 1). Davon TEC und DC sind die wichtigsten Arten von APC in einem normalen Thymus gefunden. In den letzten Jahren ist die Reinigung dieser APC-Typen für Kultur und molekularen Charakterisierung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz, Isolierung jeder dieser Zelltypen für eine detaillierte Analyse erfordert eine effiziente, reproduzierbare und kostengünstiges Verfahren. Die hier vorgestellte Methode ist eine Modifikation von bisher veröffentlichten Studien 3,4.
Wie bei jedem anderen Gewebe können Zellgewinnung aus dem Thymus von enzymatisch Disaggregation der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionsnetzwerke, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten, erreicht werden. Es gibt bestimmte Parameter, wie gut Dissoziation Effizienz, Zellausbeute, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Aufrechterhaltung des Zell surface Marker, die von entscheidender Bedeutung sind, und müssen für die erfolgreiche Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen optimiert werden.
In diesem Protokoll wird Trennung von DC und TEC Teilmengen, indem eine Einzelzell-Suspension aus dem Gewebe durch mechanische Zerstörung und enzymatischen Verdau durchgeführt. Wir verwenden Collagenase aus Clostridium histolyticum A, die ein ausgewogenes Verhältnis von verschiedenen Enzymaktivitäten hat, um die native Kollagen, die das Gewebe zusammenhält brechen. DNase I in der Enzymlösung enthalten, um die Zellaggregation durch freie DNA von toten Zellen zu reduzieren (Thymozyten sind sehr empfindlich). Wir bieten auch einen alternativen Ansatz zu den typischen enzymatische Verdauung Gewebe mit mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt. Die Einzelzellsuspension wird dann in einer einzigen Percoll-Dichte-Zentrifugation zur Anreicherung der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) von Zellen unterzogen. Von diesem Teil der Zellen kann durch Färbung DC f isoliert werdenoder DC-Oberflächenmarker (dh CD11c +) und unter Verwendung magnetische Trennung oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Gegensatz zu den lymphoiden Zellen, die große Mehrheit der Zellen in der Thymusdrüse, nicht TEC nicht exprimieren CD45 auf hohem Niveau, jedoch sind positiv für das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM. cTEC aus Mark TEC durch den Ausdruck eines noch nicht definierten Antigen durch die CDR-2 (kortikale dendritischen Retikulozyten-2)-Antikörper 4,5 und etwas niedriger EpCAM-Expression erkannt unterschieden werden. Der Differenz Co-Expression von EpCAM und CDR2 ermöglicht die effiziente Isolierung dieser TEC Teilmengen über Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung 6.
Die hier vorgestellte Protokoll ist für den menschlichen Thymus-Gewebe optimiert. Die Dauer des Verfahrens hängt von der Menge des Gewebes und der Fähigkeit der Versuchs sowie der Geschwindigkeit des Zellsortierer, wenn FACS-Sortierung verwendet. Normalerweise kann das Protokoll für die Isolierung von DC in 5 abgeschlossen-6 H und für die Isolierung von TEC in 8-10 Std. Die Trennung von DC-und TEC Teilmengen aus Thymus-Gewebe ist an der Zeit empfindlich. Je schneller die Isolierungsverfahren, die besser der Zustand der Zellen. Schließlich können die isolierten Zellen für weitere Untersuchungen, wie Vergleichsstudien von mRNA und Proteinexpression, PCR-Experimente, Proteinisolierung, molekularen Charakterisierung (dh Transkriptom, Mikro-RNA-Analyse) als auch Zellkultur 6 verwendet werden.
Ethikerklärung
Um in der Lage, mit der menschlichen Thymusgewebe arbeiten muss der Forscher der Zustimmung der lokalen Ethikkommission oder zuständigen Behörden sowie eine fundierte schriftliche Zustimmung der Spender (oder in der Regel seine Eltern, zu erhalten, da Gewebe wird in der Regel von minderjährigen erhalten Kinder). Darüber hinaus sollten alle menschlichen Gewebe als potenziell infektiös und sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, wie die Arbeit mit Handschuhen, etc. behandelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist eine Modifikation des Protokolls durch Gotters et al 4 veröffentlicht. Kritischen Schritte in dem Protokoll sind der Zustand und die ursprüngliche Herstellung des Gewebes sowie der Percoll-Dichte-Trennung. Wir empfehlen dringend, das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme zu verarbeiten. Es ist wichtig, schnell, aber gründlich zu arbeiten, wenn die Reinigung und das Schneiden des Gewebes. Während der in Schritt 2.3 beschrieben thymocyte waschen, ist es e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass die Chirurgen der Klinik für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinik Tübingen für die Bereitstellung der Proben Thymus und Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) für die Bereitstellung der CDR2-Antikörper. Wir möchten auch an Hans-Jörg Bühring und Sabrina Grimm von der Sortieranlage (Universität Tübingen) danken. Diese Arbeit wurde durch den SFB 685 und der Hertie-Stiftung unterstützt.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
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