Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса
Summary
Этот протокол детали способа, чтобы изолировать антиген представляющих клеток из человеческого тимуса через различные этапы ферментативного расщепления ткани с последующим плотности центрифугированием суспензии отдельных клеток и, наконец, магнитного и / или сортировки FACS клеточных популяций, представляющих интерес.
Abstract
В этом протоколе мы предлагаем способ, чтобы изолировать дендритные клетки (ДК) и эпителиальные клетки (TEC) из человеческого тимуса. DC и TEC являются основным антигенпрезентирующие клеток (APC) типы найдено в нормальном тимусе и это хорошо известно, что они играют различные роли в процессе тимуса выбора. Эти клетки локализованы в отдельных микросреды в тимусе, и каждый тип APC составляет лишь незначительную популяцию клеток. Для дальнейшего понимания биологии этих типов клеток, характеристика этих клеточных популяций является весьма желательным, но из-за их низкой частоты, выделение любой из этих типов клеток требует эффективного и воспроизводимого процедуру. Этот протокол детали метод получения клеток, пригодных для характеризации различных свойств клеток. Тимуса ткани механически нарушается и после различных этапов ферментативного расщепления, в результате суспензию клеток обогащается с помощью центрифугирования шаг плотности Перколла. Для выделения миелоидной постоянного тока (CD11c <SUP> +), клетки из низкой плотности фракции (ЛДФ) являются immunoselected магнитным сортировки клеток. Обогащение ТИК населения (Mtec, CTEC) достигается за счет истощения гемопоэтических (CD45 привет) клеток из низкой плотности Перколла фракции клеток, позволяя их последующую изоляцию через флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) с использованием специфических клеточных маркеров. Выделенные клетки могут быть использованы для различных последующих применений.
Introduction
Тимус является органом, в котором происходит развитие Т-клеток. Его относительное и абсолютное размер уменьшается с возрастом, когда она становится последовательно заменены жира, хотя все еще активность тимуса могут быть обнаружены в пожилом возрасте. Его значение для иммунной реакции было продемонстрировано в начале 1960-х годов 1.
Ячейка репертуар T имеет форму при взаимодействии Т-клеточных рецепторов с пептид-МНС комплексов на разных видов тимуса APC, которые обеспечивают выживание или смерть сигналы к развитию Т-клеток, в результате чего в значительной степени функциональной и само-толерантный Т-клеток репертуара 2.
Приблизительно 98% клеток в человеческом тимуса разрабатывают Т-клетки, называемые тимоцитов. Оставшиеся 2% состоят из нескольких различных типов клеток, в том числе различные TEC (корковый, медуллярный, субкапсулярной), миелоидных и плазмацитоидных DC (MDC, PDC), макрофаги, В-клетки, зрелые повторно циркулирующих Т-клетки, гранулоциты, еibroblasts, эндотелиальные клетки и очень редкие эпителиальные клетки с фенотипом экспрессии напоминающий клеток из других тканей, таких как мышцы, нейроны и респираторном эпителии (рис. 1). Из них TEC и DC основные виды APC найдено в нормальном тимусе. В последние годы, очистка этих типов APC для культуры и молекулярной профилирования приобрел все больший интерес. Из-за их низкой частоты, изоляция любой из этих типов клеток для детального анализа требует эффективного, воспроизводимый и экономичную процедуру. Метод, представленный здесь является модификацией от ранее опубликованных исследований 3,4.
Как и в любой другой ткани, извлечение клеток из тимуса может быть достигнуто путем дезагрегирования ферментативно клетка-клетка и клетка-сетей матрицы взаимодействия, с тем чтобы получить суспензию единичных клеток. Есть определенные параметры, такие как хорошая эффективность диссоциации, выход клеток, жизнеспособность клеток и удержания клеток сПоверхность маркеры, которые имеют решающее значение и должны быть оптимизированы для успешного выделения этих редких клеточных популяций.
В этом протоколе, выделение постоянного тока и TEC подмножеств выполняется, сделав одной клеточной суспензии ткани с помощью механического разрушения и ферментативного расщепления. Мы используем коллагеназы А из Clostridium histolyticum, который имеет сбалансированное соотношение различных видов деятельности ферментных, чтобы сломать родной коллаген, который удерживает ткани вместе. ДНКазы I входит в ферментного раствора для снижения агрегации клеток за счет свободной ДНК от мертвых клеток (тимоцитов очень чувствительны). Мы также предлагаем альтернативный подход к типичному ферментативного переваривания ткани с участием механическую и ферментативную обработку тканей при содействии ткани диссоциатора. Одноклеточной суспензии затем подвергают одной Перколла плотности центрифугирования для обогащения низкой плотности фракции (LDF) клеток. С этой фракции клеток, DC, могут быть выделены путем окрашивания еили DC-поверхностные маркеры (т.е. CD11c +) и с помощью магнитной сепарации или флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS). В отличие от лимфоидных клеток, составляющих подавляющее большинство клеток в тимусе, TEC не выражают CD45 на высоких уровнях, но положительны для ЕрСАМ молекулы эпителиальной клеточной адгезии. CTEC можно отличить от мозгового TEC по экспрессии еще неопределенной антигена, признанной CDR-2 (коркового дендритных ретикулоцитов-2) антител 4,5 и несколько ниже выражения EpCAM. Дифференциальный коэкспрессия ЕрСАМ и CDR2 позволяет эффективно выделение этих ТИК подмножеств через высокоскоростной сортировки клеток 6.
Протокол, представленные здесь оптимизирован для человеческого тимуса ткани. Длительность процедуры зависит от количества ткани и способности экспериментатора, а также от скорости клеточного сортера, если используется FACS сортировки. Как правило, протокол для выделения DC может быть завершена в течение 5-6 Ч и для выделения TEC в 8-10 час. Изоляция постоянного и ТИК подмножеств из тимуса ткани чувствительным временем. Чем быстрее процедура изоляции, тем лучше состояние клеток. Наконец, изолированные клетки могут быть использованы для дальнейших исследований, таких как сравнительных исследований мРНК и белка, ПЦР экспериментов, изоляции белка, молекулярной профилирования (т.е. транскриптомика, микро-анализа РНК), а также клеточной культуре 6.
Заявление по этике
Для того, чтобы иметь возможность работать с человеческой ткани тимуса исследователь должен получить одобрение от местным комитетом по этике или ответственными органами, а также информированного письменного согласия донора (или обычно его или ее родителей, так как ткани, как правило, получают из несовершеннолетних детей). Кроме того, все ткани человека следует обращаться как с потенциально инфекционные и соответствующие меры должны быть приняты, такие как работа в перчатках, и т.д..
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, является модификацией протокола опубликован Götter и др. 4. Критические шаги в протоколе являются состояние и начальная подготовка ткани, а также разделение плотность Перколла. Мы настоятельно рекомендуем, чтобы обработать ткань как можно скорее пос?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны хирургов кафедрой торакальной и сердечно-сосудистой хирургии, университетской клинике Тюбинген за предоставление нам образцов тимуса и Бруно Kyewski (DKFZ, Гейдельберг, Германия) за предоставление антитела CDR2. Мы также хотели бы поблагодарить Ханс-Йорг Bühring и Сабрина Гримм от сортировочной установки (Университет Тюбинген). Эта работа была поддержана SFB 685 и Херти.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
