Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano
En este artículo
Resumen
Resumen
En este protocolo se proporciona un método para aislar células dendríticas (DC) y células epiteliales (TEC) de la timo humano. DC y TEC son la principal célula presentadora de antígeno (APC) tipos que se encuentran en un timo normal y está bien establecido que desempeñan papeles distintos durante la selección tímica. Estas células se localizan en distintos microambientes en el timo y cada tipo de APC constituye sólo una población menor de células. Para entender mejor la biología de estos tipos de células, la caracterización de estas poblaciones de células es altamente deseable, pero debido a su baja frecuencia, el aislamiento de cualquiera de estos tipos de células requiere un procedimiento eficaz y reproducible. Este protocolo detalla un método para obtener células adecuadas para la caracterización de diversas propiedades celulares. Tejido tímico se interrumpe mecánicamente y después de diferentes pasos de la digestión enzimática, la suspensión de células resultante se enriquece usando una etapa de centrifugación de densidad de Percoll. Para el aislamiento de CC mieloide (CD11c <sup> +), las células de la fracción de baja densidad (LDF) se inmunoselecciona por clasificación celular magnética. Enriquecimiento de las poblaciones de TEC (MTEC, ctec) se logra por el agotamiento de las células hematopoyéticas (CD45 hi) de la fracción de células de Percoll de baja densidad que permite su posterior aislamiento a través de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcadores de células específicos. Las células aisladas se pueden utilizar para diferentes aplicaciones posteriores.
Introducción
El timo es el órgano en el que se produce el desarrollo de células T. Su tamaño relativo y absoluto disminuye con la edad cuando se convierte sustituido sucesivamente por la grasa a pesar de la actividad del timo todavía se puede detectar en la vejez. Su importancia para la respuesta inmune se demostró a principios del decenio de 1960 1.
El repertorio de células T se forma a través de la interacción de receptores de células T con complejos de péptido-MHC en diferentes tipos de timo de APC, que proporcionan señales de supervivencia o muerte para el desarrollo de las células T, lo que resulta en un repertorio de células T funcion....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de herramientas, soluciones de enzimas y tampones
Lleve a cabo los siguientes pasos de preparación antes de comenzar el protocolo.
- Instrumentos
Limpio, seco y autoclave las siguientes herramientas y mantenerlos en envases estériles hasta su uso.- Tijeras afiladas pequeños con puntas curvo o recto para cortar el tejido del timo. Pinzas curvas pequeñas con puntas estriadas para la manipulación de los tejidos.
- 50 ml de la Oak Ridge Tubos de centrífuga, PC, para la etapa de centrifugación Percoll densidad.
- Las soluciones enzimáticas
Preparar la colagenasa / DNasa I ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como material de partida en este protocolo se utiliza tejido del timo retirado de los niños sometidos a cirugía cardiovascular correctiva (Departamento de Cirugía Torácica y Cardiovascular, Clínica Universitaria de Tubinga) obtenidas después de consentimiento informado y bajo las directrices del centro. Este material de desecho puede variar mucho en tamaño de 2 a 30 g o más. El número de MDC y subconjuntos TEC (ctec y MTEC) que se obtienen dependen del tamaño, así como la edad de la muestra de tejido de timo usada para .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo aquí descrito es una modificación del protocolo publicado por Gotter et al 4. Los pasos críticos en el protocolo son la condición y la preparación inicial del tejido, así como la separación por densidad de Percoll. Recomendamos para procesar el tejido tan pronto como sea posible después de su recolección. Es importante trabajar rápido pero bien al limpiar y cortar el tejido. Durante el lavado de timocitos se describe en el paso 2.3, es fundamental encontrar el equilibrio adecuado en la a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Ningún conflicto de interés declarado.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a los cirujanos del Departamento de Cirugía Torácica y Cardiovascular, Clínica Universitaria de Tubinga por proporcionarnos las muestras de timo y Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Alemania) para proporcionar el anticuerpo CDR2. También nos gustaría dar las gracias a Hans-Jörg Bühring y Sabrina Grimm de las instalaciones de clasificación (Universidad de Tubinga). Este trabajo fue apoyado por el SFB 685 y la Fundación Hertie.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos y Materiales | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| PBS PAA de Dulbecco | H15-002 | ||
| Suero Fetal Bovino-Oro | PAA | A15-151 | |
| Albúmina sérica bovina | PAA | K41-001 | |
| Colagenasa A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNasa I, grado II páncreas bovino | Roche | 10 104 159 001 | |
| Tripsina-EDTA 10x en PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Kit de etiquetado de proteínas Sondas | moleculares | A-10235 | |
| anti-humano CDR2 (purificado) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Alemania | etiquetado con Alexa Fluor 488 | |
| anti-humano CD45 (Azul del Pacífico) | Biolegend | 304022 | |
| EpCAM antihumano (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| antihumano CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| microperlas anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| microperlas anti-CD45, humano | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| Columnas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubos | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | para disociador de tejidos |
| Percoll (densidad 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Agua destilada estéril (libre de ADNasa/ARNasa) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | predilución 1:10, usar 20 μ l/1 x 106celdas |
| 0,22 μ m filtro | Millex GS SLGS033SS | Accionado por jeringa | |
| Unidad de filtro Stericup | Millipore | SCGPU05RE | Accionado por bomba |
| 50 ml PC tubos centrífugos de cresta de roble | Nalgene | 3118-0050 | 50 |
| ml 50 ml Tubos cónicos PP | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm Tubos de ensayo de 5 ml | Becton Dickinson | 352058 | Tinciones FACS |
| Filtro de células 70 μ m | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Medidor de Citómetro-Flujo (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotador REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Disociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | disociador de tejidos |
Referencias
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and c....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
