Summary

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Published: September 19, 2013
doi:

Summary

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

Abstract

Bu protokolde, insan timus dendritik hücreler (DC) ve epitel hücreleri (TEC) izole etmek için bir yöntem sağlar. DC ve TEC büyük antijen sunan hücre normal timus bulundu (APC) türleri vardır ve iyi onlar timus seçimi sırasında farklı rolleri oynadığı kurulmuştur. Bu hücreler, timus ayrı mikroçevrelerde lokalize ve her APC tür hücrelerin sadece küçük bir popülasyonu oluşturan vardır. Bundan başka, bu hücre tiplerinin biyolojisi anlamak için, bu hücre popülasyonlarının tanımlanması oldukça tercih edilir ama nedeniyle düşük bir frekansa, bu hücre tiplerinin herhangi birinden izolasyonu etkili ve yeniden üretilebilir bir prosedürü gerektirir. Bu protokol, çeşitli hücresel özellikleri karakterizasyonu için uygun hücrelerin elde edilmesi için bir yöntem göstermektedir. Timus doku mekanik olarak bozulur ve enzimatik sindirme farklı adımları sonra, elde edilen hücre süspansiyonu bir Percoll yoğunluk santrifüjleme aşaması kullanılarak zenginleştirilmiştir. Miyeloid DC (CD11c'nin izolasyonu için <sup> +), düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) gelen hücreler, manyetik hücre sıralama ile immunoselected edilir. TEC popülasyonlar (MTec, CTEC) zenginleştirilmesi spesifik hücre markörleri kullanılarak (FACS) floresan aktive hücre aracılığı ile daha sonra izole edilmesini sağlayan düşük yoğunluklu Percoll hücre fraksiyonundan hematopoietik (CD45 hi) hücrelerinin tükenmesi ile elde edilir. Izole edilmiş hücreler, farklı alt uygulamalar için kullanılabilir.

Introduction

Timus T hücresi gelişme cereyan ettiği bir organdır. Timik aktivitesi hala yaşlılıkta tespit edilebilir, ancak bu durumda sürekli olarak yağ ile ikame olur zaman onun nispi ve mutlak büyüklüğü yaşla birlikte azalır. Immün tepkisi için önemi 1960'ların 1 'de gösterilmiştir.

T hücresi işlevsel bir repertuar ve büyük ölçüde kendi kendine dayanıklı T hücresi repertuarının 2 ile sonuçlanan T hücrelerinin gelişmekte olan hayatta kalma ya da ölüm ipuçları sağlamak timik APC farklı ilgili MHC-peptid kompleksleri ile T hücresi reseptörlerinin etkileşimi yoluyla şekillenir.

Insan timus hücrelerin yaklaşık% 98 timositlerde olarak adlandırılan T hücreleri geliştirmektedir. Geriye kalan,% 2, bir TEC çeşitli (kortikal, medüller, subkapsüler), miyeloid ve plazmasitoid DC (MDC, pDC), makrofajlar, B hücreleri, olgun yeniden dolaşan T hücreleri, granülositler gibi farklı hücre tipleri, bir dizi oluşmaktadır fbir ekspresyon fenotipli ibroblasts, endotelyal hücrelerin ve çok nadir epitel hücreleri, kas, nöronlar ve solunum yolu epitel gibi diğer dokuların (Şekil 1) gelen hücre benzeyen. Bunlardan, TEC ve DC normal timus bulunan başlıca APC türleridir. Son yıllarda, kültür ve moleküler profili çıkartmak için, bu tip APC saflaştırılması daha fazla ilgi görmüştür. Nedeniyle düşük bir frekansa, ayrıntılı analiz için, bu hücre tiplerinin herhangi birinin izolasyonu etkin, tekrarlanabilir ve maliyet-etkin bir prosedürü gerektirir. Burada sunulan yöntem, daha önce yayınlanmış çalışmalar 3,4 'den bir modifikasyonudur.

Başka bir doku gibi, timüs hücre ekstre enzimatik olarak tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşim ağları ayırmak ile elde edilebilir. Iyi ayrışma verimliliği, hücre verimi, hücre canlılığı ve hücre s tutma gibi bazı parametreler vardırönemli olan ve sert bir yere belirteçler bu nadir hücre popülasyonlarının başarılı bir şekilde izole edilmesi için optimize edilmesi gerekir.

Bu protokol, DC ve alt-TEC izolasyonu mekanik parçalama ve enzimatik sindirme ile doku tek hücre süspansiyonu yaparak gerçekleştirilir. Biz doku bir arada tutan yerli kolajen yıkmak için, farklı enzim aktiviteleri dengeli bir orana sahiptir Clostridium histolyticum'dan, gelen Kolajenaz A kullanın. DNase I (timositleri çok hassastır). Ayrıca bir doku ayrıştırıcı yardımıyla mekanik ve enzimatik doku tedavi ile ilgili tipik bir enzimatik Doku sindirimi için alternatif bir yaklaşım sağlar nedeniyle ölü hücrelerden serbest DNA hücre agregasyonunu azaltmak için enzim çözeltisi dahildir. Tek hücre süspansiyonu daha sonra hücre düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) zenginleştirilmesi için tek bir Percoll yoğunluk santrifüj işlemine tabi tutulur. Hücrelerin bu fraksiyondan DC f boyama izole edilebilirya da DC-yüzey belirteçleri (örneğin, CD11c +) ve manyetik ayırma veya floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak. Timus hücrelerin büyük bir çoğunluğu içeren lenfoid hücrelerinin aksine, TEC yüksek seviyelerde CD45 eksprese ancak epitelyal hücre yapışma molekülü EpCAM pozitif olan yoktur. CTEC CDR-2 (kortikal dendritik retikülosit-2) antikoru 4,5 ve daha düşük EpCAM ifadesi tarafından tanınan bir henüz tanımlanmamış antijeninin ekspresyonu ile medüller TEC ayırt edilebilir. Diferansiyel EpCAM ve CDR2 eş ifadesi, yüksek hızlı bir hücre ile bu alt-TEC etkin yalıtım 6 ayırma sağlar.

Burada sunulan protokol, insan timus dokusu için optimize edilmiştir. FACS kullanılması halinde, prosedürün süresi, doku miktarı ve deneyi yeteneği hem de hücre sıralayıcı hızına bağlıdır. Normal olarak, DC izolasyonu için protokol 5 içinde tamamlanabilir-6 Hr ve 8-10 saat içinde TEC izolasyonu için. Timik doku DC ve TEC altkümelerin izolasyon zaman duyarlı. Daha hızlı izolasyon prosedürü, hücrelerin durumu daha iyi. Son olarak, izole edilmiş hücreler mRNA karşılaştırmalı çalışmalar ve protein ifadesi, PCR deneyleri, protein izolasyon, moleküler profili (yani transkriptomik, mikro RNA analizi) yanı sıra hücre kültürü 6 gibi daha ileri araştırmalar için de kullanılabilir.

Etik Bildirimi

Insan timus dokusu ile çalışmak edebilmek amacıyla araştırmacı doku genellikle reşit elde beri yerel etik kurul veya sorumlu makamlar yanı sıra donörün bilinçli bir yazılı izni (ya da genellikle kendi anne, onay almak gerekiyor çocuklar). Ayrıca, tüm insan dokuları potansiyel bulaşıcı ve uygun önlemlerin vb, eldiven ile çalışma gibi, alınmalıdır olarak ele alınmalıdır.

Protocol

1.. Araçlar, Enzim Çözümleri ve Tamponlar hazırlanması Protokol başlamadan önce aşağıdaki hazırlık adımları gerçekleştirin. Araçlar Temiz, kuru ve aşağıdaki araçları otoklav ve kullanıma kadar steril bir paket içinde saklayın. Timus doku kesmek için kavisli veya düz ya da ipuçları ile küçük keskin makas. Doku kullanımı için tırtıklı ipuçları ile küçük kavisli forseps. Percoll yoğunluklu santrifüjleme aşaması…

Representative Results

Bu protokolde, başlangıç ​​malzemesi olarak biz bilgilendirilmiş rıza sonra ve kurumsal kurallar altında elde edilen düzeltici kardiyovasküler cerrahi (Bölüm Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi, Üniversite Kliniği Tuebingen) geçiren çocuklarda çıkarılan timus doku kullanın. Bu atılan malzeme 2-30 g veya daha fazla boyutu büyük ölçüde değişebilir. Elde edilir MDC sayısı ve TEC alt-gruplar (CTEC ve MTec) boyut olarak hem de izolasyonu için kullanılan timus doku örneğinin yaşına bağlıd?…

Discussion

Burada açıklanan protokol Götter ve arkadaşları tarafından yayımlanan 4 protokol bir modifikasyonudur. Protokolde kritik adım durumu ve doku ilk hazırlanması hem de Percoll yoğunluk ayrılması bulunmaktadır. Önemle kısa sürede toplandıktan sonra doku işlemek için tavsiye. Bu temizlik ve doku keserken hızlı ama iyice çalışmak önemlidir. Adım 2.3 'de tarif edilen timosit yıkama sırasında, stromal hücrelere zarar verebilir çok güçlü ve uzun süreli basınç doku par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz CDR2 antikorun sağlanması için timus örnekler ve Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Almanya) ile bize sağlamak için Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, Üniversite Kliniği Tuebingen cerrahlar için minnettarız. Biz de sıralama tesisinin (Tübingen Üniversitesi) Hans-Jörg Bühring ve Sabrina Grimm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma SFB 685 ve hertie Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Reagents and Materials
RPMI 1640 PAA E15-842
Dulbecco's PBS PAA H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold PAA A15-151
Bovine Serum Albumin PAA K41-001
Collagenase A Roche 10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic Roche 10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS PAA L11-001 stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit Molecular Probes A-10235
anti-human CDR2 (purified) Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue) Biolegend 304022
anti-human EpCAM (APC) Miltenyi Biotec 130-091-254
anti-human CD11c (PE) Miltenyi Biotec 130-092-411
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml) GE Healthcare, Life Sciences 17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) GIBCO 10977-035
Gamunex 10% Tajecris-Biotherapeutics G120052 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter Millex GS SLGS033SS Syringe driven
Stericup filter unit Millipore SCGPU05RE Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0050 50 ml
50 ml PP conical tubes Becton Dickinson 352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes Becton Dickinson 352058 FACS stainings
Cell strainer 70 μm Becton Dickinson 352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor) Kendro
Rotator REAX 2 Heidolph
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093 235 tissue dissociator

References

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

Play Video

Cite This Article
Stoeckle, C., Rota, I. A., Tolosa, E., Haller, C., Melms, A., Adamopoulou, E. Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus. J. Vis. Exp. (79), e50951, doi:10.3791/50951 (2013).

View Video