Les isozymes lipoxygénase (LOX) peuvent générer des produits qui peuvent augmenter ou diminuer la neuroinflammation et la neurodégénérescence. Une étude d’interaction gène-environnement pourrait identifier les effets spécifiques de l’isozyme LOX. L’utilisation du modèle 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) des dommages nigrostriatal dans deux lignées transgéniques déficientes en isozyme LOX permet de comparer la contribution des isozymes LOX sur l’intégrité dopaminergique et l’inflammation.
L’activité de la lipoxygénase (LOX) a été impliquée dans des désordres neurodegenerative tels que la maladie d’Alzheimer, mais ses effets dans la pathogénie de la maladie de Parkinson (palladium) sont moins compris. Les modèles d’interaction gène-environnement ont l’utilité de démasquer l’impact de voies cellulaires spécifiques dans la toxicité qui peuvent ne pas être observées en utilisant uniquement un modèle de maladie génétique ou toxique. Pour évaluer si les isozymes distincts de LOX contribuent sélectivement au neurodegeneration PD-connexe, des souris transgéniques(c.-à-d. 5-LOX et 12/15-LOX déficientes) peuvent être contestées avec une toxine qui imite des dommages de cellules et la mort dans le désordre. Ici nous décrivons l’utilisation d’une neurotoxine, 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), qui produit une lésion nigrostriatal pour élucider les contributions distinctes des isozymes de LOX au neurodegeneration lié au palladium. L’utilisation de MPTP chez la souris, et le primate non humain, est bien établie pour récapituler les dommages nigrostriatal dans le palladium. L’ampleur de la lésion causée par MPTP est mesurée par l’analyse hplc de la dopamine et de ses métabolites et l’analyse occidentale semi-quantitative de tache du striatum pour l’hydroxylase de tyrosine (TH), l’enzyme taux-limitante pour la synthèse de la dopamine. Pour évaluer les marqueurs inflammatoires, qui peuvent démontrer la sensibilité isozyme-sélective de LOX, la protéine acide fibrillaire glial (GFAP) et immunohistochemistry Iba-1 sont exécutées sur des sections de cerveau contenant le nigra de substantia, et l’analyse occidentale de tache de GFAP est exécutée sur des homogénats striatal. Cette approche expérimentale peut fournir de nouvelles informations sur les interactions gènes-environnement sous-jacentes à la dégénérescence nigrostriatale et à la MP.
L’utilisation de modèles d’interaction gène-environnement fournit une approche pour imiter les facteurs de risque qui influencent probablement la maladie de Parkinson idiopathique (MP) et offre l’occasion de discerner des idées mécanistes qui sont peu susceptibles d’être élucidées par l’utilisation d’un système génétique ou toxique seul1,2. Ici nous illustrant ce point et décrivons l’application du modèle murin 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) de la dégénérescence nigrostriatale3 pour mieux comprendre la sélectivité de l’activité isozyme de la lipoxygénase (LOX) sur la neuroinflammation et la toxicité4. Tandis qu’un rôle pour des isozymes de LOX a été largement évalué dans les désordres périphériques5,6 aussi bien que la maladie de CNS comprenant la course7 et la maladie d’Alzheimer8,9, le rôle de la famille des isozymes dans la fonction nigrostriatal et la dégénérescence liée au palladium n’est pas bien compris et justifie l’étude. La neurotoxine MPTP démontre la dégénérescence préférentielle de la voie nigrostriatal et récapitule l’épuisement striatal de dopamine et la perte dopaminergiquenigrale de cellules qui sont à la base des affaiblissements moteurs dans des patients depalladium 10. Bien que ce modèle ne reproduise pas le cadre complet des comportements de non moteurs et moteurs et de la pathologie du corps de Lewy α-synucléine-positive, il a été utile d’élucider de nouvelles cibles mécanistes qui contribuent aux dommages nigrostriatal et pour les tests translationnels à un stade précoce, car c’est le modèle non invasif le mieux caractérisé disponible pour produire de manière fiable la mort cellulaire nigrale accompagnée d’une perte de dopamine striatale11-15. L’utilisation large de la souris MPTP, avec des paradigmes allant de aiguë, subaiguë à chronique16-18, a permis la normalisation du dosage pour entraîner des dommages nigrostriatal légers à graves19,20 avec activation de différents mécanismes de toxicité en fonction du schéma thérapeutique18,21,22. Par conséquent, cela permet de cibler une « fenêtre de lésion » qui peut entraîner une lésion nigrostriatale accrue ou réduite en fonction de l’agent thérapeutique ou du modèle transgénique utilisé23-25.
Les techniques utilisées pour évaluer les dommages et les preuves que ces méthodes fournissent sont également essentielles pour les études de biologie translationnelle et de découverte. Pour le modèle murin MPTP, les mesures établies pour évaluer la lésion sont la mesure des marqueurs du tonus dopaminergique striatal, y compris la dopamine et ses métabolites par HPLC, et l’analyse western blot de la tyrosine hydroxylase (TH), l’enzyme limitant le taux dans la synthèse de la dopamine, et les indicateurs d’événements dégénératifs tels que l’activation gliale à l’aide de l’analyse western blot et de l’immunohistochimie4. Bien que ce soient des procédures neurochimiques, biochimiques, et histologiques classiques, les techniques fournissent des lectures critiques et reproductibles sur l’ampleur des dommages dans la voie dopaminergique nigrostriatal, indiquent des mécanismes de toxicité, et se sont avérées être des outils précieux en comprenant des événements dégénératifs dans le palladium.
La conception de cette étude d’interaction gène-environnement nous a permis d’obtenir de nouvelles informations concernant la double nature de l’isozyme 5-LOX dans la voie nigrostriatal. En effectuant hplc pour mesurer les monoamines striatal après traitement salin ou MPTP dans les transgéniques dépourvus de l’isozyme 5-LOX et leurs littermates de type sauvage, nous avons pu noter que sa carence semble être protectrice dans des conditions toxiques (Figure 1), mais dans des conditions norma…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été financés par le NIGMS 056062 des National Institutes of Health.
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling | |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation | |
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization | |
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay | |
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection | |
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination | |
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE | |
Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE | |
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE | |
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer | |
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers | |
Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting | |
Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting | |
Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting | |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence | |
goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence | |
goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting | |
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting | |
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC | |
Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC | |
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC | |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC | |
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC | |
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC | |
Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC | |
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) | |
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) | |
Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC | |
Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC | |
Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC | |
95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC | |
100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC | |
DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC | |
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting | |
Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC | |
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC | |
Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC | |
Perchloric acid (PCA) – 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC | |
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC | |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC | |
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | ||
0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | ||
Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC | |
[header] | ||||
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | ||
ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | |||
HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | ||
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | ||
Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | ||
Guard Cell | ESA | 5020 | ||
Analytical Cell | ESA | 5011A | ||
Chromeleon software | Dionex | |||
Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope | |
Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | ||
Microfilter top | Ancare | N10MBT | ||
[header] | ||||
5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | ||
12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |