ליפוקסיג’נאז (LOX) isozymes יכול לייצר מוצרים שעשויים להגדיל או להקטין נוירואינפלמציה ו ניוון עצבי. מחקר אינטראקציה גנטית-סביבה יכול לזהות LOX השפעות ספציפיות isozyme. באמצעות 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל של נזק nigrostriatal בשני קווים מהונדסים LOX isozyme לקוי מאפשר להשוות את התרומה של איזוזימים LOX על שלמות דופאמין ודלקת.
פעילות Lipoxygenase (LOX) כבר מעורב בהפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, אבל השפעותיו מחלת פרקינסון (PD) פתוגנזה מובנים פחות. מודלים של אינטראקציה בין סביבת גנים יש תועלת לחשוף את ההשפעה של מסלולים תאיים ספציפיים רעילות כי לא ניתן לראות באמצעות מודל מחלה גנטית או רעילה בלבד. כדי להעריך אם isozymes LOX נפרדים באופן סלקטיבי לתרום ניוון עצבי הקשורות PD, מהונדס (כלומר 5-LOX ו 12/15-LOX לקוי) עכברים ניתן לאתגר עם רעלן המחקה פגיעה בתא ומוות בהפרעה. כאן אנו מתארים את השימוש של רעלן עצבי, 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), אשר מייצר נגע nigrostriatal כדי להבהיר את התרומות המובהק של LOX isozymes לניוון עצבי הקשורים PD. השימוש MPTP בעכבר, ופרימט לא אנושי, מבוסס היטב כדי לסכם את הנזק nigrostriatal ב PD. היקף הנגע הנגרמת על ידי MPTP נמדד על ידי ניתוח HPLC של דופמין והמטבוליטים שלו וניתוח כתמים מערביים חצי כמותיים של סטריאטום לטירוסין הידרוקסילאז (TH), האנזים המגביל את הקצב לסינתזה של דופמין. כדי להעריך סמנים דלקתיים, אשר עשוי להדגים רגישות LOX isozyme סלקטיבית, חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP) ו Iba-1 אימונוהיסטוכימיה מבוצעים על קטעי המוח המכילים סובסטנציה ניגרה, וניתוח כתם מערבי GFAP מבוצע על הומוגנטים סטריאטליים. גישה ניסיונית זו יכולה לספק תובנות חדשניות על אינטראקציות בין סביבות גנים שבבסיס ניוון nigrostriatal ו PD.
שימוש במודלים של אינטראקציה בין גנים לסביבה מספק גישה לחיקוי גורמי סיכון שעשויים להשפיע על מחלת פרקינסון אידיופטית (PD) ומעניק הזדמנות להבחין בתובנות מכניות שלא סביר שיבהירו אותן על ידי שימוש במערכת גנטית או רעילה בלבד1,2. כאן אנו ממחישים נקודה זו ומתארים את היישום של 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל העכבר של ניוון nigrostriatal3 כדי להבין טוב יותר את הסלקטיביות של ליפוקסיגנאז (LOX) פעילות איזוזימה על נוירואינפלמציה ורעילות4. בעוד תפקיד עבור ISOZYmes LOX הוערך באופן נרחב בהפרעות היקפיות5,6, כמו גם מחלת מערכת העצבים המרכזית כוללשבץ 7 ומחלת אלצהיימר8,9, התפקיד של המשפחה של isozymes בתפקוד nigrostriatal ניוון הקשורים PD אינו מובן היטב ומצדיק מחקר. הרעלן העצבי MPTP מדגים ניוון מועדף של המסלול nigrostriatal ו recapitulates דלדול דופמין סטריאטלי ואובדן תאים דופאמין nigral כי ביסוד ליקויים מוטוריים בחולי PD10. בעוד מודל זה אינו לשחזר את הסגל המלא של התנהגויות PD nonmotor ומנוע פרנק α-synuclein חיובי לוי גוף פתולוגיה, זה כבר שימושי כדי להבהיר מטרות מכניות הרומן שתורמים נזק nigrostriatal עבור בדיקות תרגום בשלב מוקדם כפי שהוא המודל המאופיינת הטובה ביותר לא פולשני זמין לייצר מוות תאי ניגרל מלווה אובדן דופמין סטריאטלי11-15. שימוש נרחב בעכבר MPTP, עם פרדיגמות החל חריפה, subacute כדיכרונית 16-18, אפשרה סטנדרטיזציה של מינון לגרום נזק nigrostriatal קל עד חמור19,20 עם הפעלת מנגנונים שונים של רעילות בהתאם משטר הטיפול18,21,22. כתוצאה מכך, זה מאפשר ‘חלון של נגע’ להיות ממוקד שעלול לגרום לפציעה nigrostriatal משופרת או מופחתת בהתאם לסוכן הטיפולי או מודל מהונדס מנוצל23-25.
כמו כן חיוני למחקרים ביולוגיים תרגום וגילוי הם הטכניקות המשמשות להערכת נזק ואת הראיות שיטות כאלה לספק. עבור מודל העכבר MPTP, מדדים הוקמה כדי להעריך נגעים הם מדידה של סמנים של טון דופאמין סטריאטלי, כולל דופמין מטבוליטים שלה על ידי HPLC, וניתוח כתם מערבי של טירוסין hydroxylase (TH), האנזים הגבלת קצב סינתזה דופמין,ואינדיקטורים של אירועים ניווניים כגון הפעלה גלית באמצעות ניתוח כתם מערבי immunostochemist. למרות שמדובר בהליכים נוירוכימיים, ביוכימיים והיסטולוגיים קלאסיים, הטכניקות מספקות קריאות קריטיות וניתנות לשחזור על היקף הנזק בתוך המסלול הדופאמינרגי הניגרוסטריאטי, מצביעות על מנגנוני רעילות, והוכיחו את עצמן ככלים חשובים להבנת אירועים ניווניים בפ”ד.
העיצוב של מחקר זה אינטראקציה גנים-סביבה אפשר לנו לקבל מידע חדש לגבי האופי הכפול של isozyme 5-LOX במסלול nigrostriatal. על ידי ביצוע HPLC למדידת מונואמינים סטריאטליים לאחר טיפול מלוחים או MPTP בחומרים מהונדסים חסרים isozyme 5-LOX ואת המלטה שלהם סוג פראי, הצלחנו לציין כי המחסור שלה נראה מגן בתנאים רעילים (איו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS 056062.
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling | |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation | |
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization | |
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay | |
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection | |
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination | |
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE | |
Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE | |
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE | |
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer | |
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers | |
Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting | |
Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting | |
Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting | |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence | |
goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence | |
goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting | |
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting | |
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC | |
Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC | |
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC | |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC | |
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC | |
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC | |
Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC | |
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) | |
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) | |
Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC | |
Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC | |
Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC | |
95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC | |
100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC | |
DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC | |
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting | |
Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC | |
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC | |
Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC | |
Perchloric acid (PCA) – 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC | |
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC | |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC | |
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | ||
0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | ||
Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC | |
[header] | ||||
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | ||
ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | |||
HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | ||
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | ||
Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | ||
Guard Cell | ESA | 5020 | ||
Analytical Cell | ESA | 5011A | ||
Chromeleon software | Dionex | |||
Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope | |
Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | ||
Microfilter top | Ancare | N10MBT | ||
[header] | ||||
5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | ||
12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |