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Medicine

파킨슨 병에서 감수성 메커니즘을 마스크를 해제하는 유전자 환경 상호 작용 모델

Published: January 07, 2014
doi:
10.3791/50960
, , ,
1Center for Health Sciences,SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry,University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

Abstract

Lipoxygenase (LOX) 활동은 알츠하이머 병과 같은 신경 퇴행성 질환에 연루되었지만 파킨슨 병 (PD) 병기 발생에 미치는 영향은 덜 이해됩니다. 유전자 환경 상호 작용 모델은 단독으로 유전 적 또는 독성 질병 모델을 사용하여 관찰되지 않을 수 있는 독성에 있는 특정 세포 통로의 충격을 마스킹해제에 있는 유틸리티가 있습니다. 뚜렷한 LOX 이소지메스가 PD 관련 신경변성에 선택적으로 기여하는지 평가하기 위해,형질전환(즉, 5-LOX 및 12/15-LOX 결핍) 마우스는 장애에서 세포 손상과 사망을 모방한 독소로 도전할 수 있다. 여기서 우리는 PD와 관련된 신경 변성에 LOX isozymes의 뚜렷한 기여를 해명하기 위해 nigrostriatal 병변을 생성하는 신경 독소, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라 하이드로피리딘 (MPTP)의 사용을 설명합니다. 마우스에 MPTP의 사용, 비 인간 영장류, PD의 nigrostriatal 손상을 재현하기 위해 잘 설립된다. MPTP 유도 병변의 정도는 도파민의 HPLC 분석과 대사산물 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 스트리에이텀의 반정성 서양 얼룩 분석에 의해 측정되며, 도파민합성을 위한 속도 제한 효소이다. LOX 이소지메 선택적 감도를 입증할 수 있는 염증성 마커를 평가하기 위해, 글리아 세동 산성 단백질(GFAP) 및 이바-1 면역조직화학은 실질적인 니그라를 함유하는 뇌 단면에서 수행되며, GFAP 웨스턴 블롯 분석은 현저균질상에서 수행된다. 이 실험적인 접근은 nigrostriatal 변성 및 PD의 근본적인 유전자 환경 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

유전자 환경 상호 작용 모델의 사용은 특발성 파킨슨 병 (PD)에 영향을 미칠 가능성이 있는 위험 요소를 모방하는 접근법을 제공하고 유전적 또는 독성 시스템만1,2를사용하여 해명될 가능성이 없는 기계론적 통찰력을 분별할 수 있는 기회를 제공한다. 여기서 우리는 이 점을 설명하고 신경염증 및독성에대한 립산소증(LOX)의 선택성을 더 잘 이해하기 위해 니그로스트리아탈 변성3의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델의 적용을 설명한다. LOX isozymes에 대한 역할은 뇌졸중7 및 알츠하이머 병8,9를포함한 CNS 질환뿐만 아니라 말초 장애5,6에서 널리 평가되었지만, PD와 관련된 니그로스 트리아탈 기능 및 변성에서 이소지메의 가족의 역할은 잘 이해되지 않고 연구를 보증한다. MPTP 신경독소는 니그로스트리아탈 통로의 우대변성을 입증하고 PD환자(10)의운동장애를 뒷받침하는 스트루아탈 도파민 고갈 및 니그랄 도파민 세포 손실을 재구성한다. 이 모델은 비운동 및 모터 PD 행동과 솔직한 α-synuclein 양성 Lewy 신체 병리학의 전체 간부를 재현하지는 않지만, 111에 의해 안정적으로 nigral cell death를 생산할 수 있는 최고의 특성이 있는 비침범성 모델이기 때문에 nigrostriatal 손상및초기 단계 번역 테스트에 기여하는 새로운 기계성 표적을 해명하는 데 유용했습니다. 급성, 아급성에서 만성16-18에이르기까지 패러다임으로 MPTP 마우스의 광범위한 사용은 치료요법18,21,22에따라 다른 독성 메커니즘의 활성화와 함께19,20에서 심한 nigrostriatal 손상으로 가벼운 결과를 초래하는 투약의 표준화를 허용했다. 따라서, 이는23-25를활용한 치료제 또는 형질전환 모델에 따라 개선되거나 감소된 니그로스트라탈 손상을 초래할 수 있는 ‘병변의 창’을 허용한다.

또한 번역 및 발견 생물학 연구 결과에 필수적인 손상을 평가하는 데 사용되는 기술과 그러한 방법이 제공하는 증거입니다. MPTP 마우스 모델의 경우, 병변을 평가하기 위한 확립된 지표는 HPLC에 의한 도파민 및 대사산물을 포함한 현트리아탈 도파민의 마커, 티로신 하이드록실라제(TH), 도파민 합성의 속도 제한 효소 및 면역학적 인 비올레를 이용한 퇴행성 발생의지표이다. 이들은 고전적인 신경 화학, 생화학적, 및 조직학적 절차이지만, 기술은 nigrostriatal dopaminergic 통로 내의 손상의 정도에 중요하고 재현 가능한 판독을 제공하고, 독성의 메커니즘을 나타내며, PD의 퇴행성 사건을 이해하는 데 중요한 도구가 입증되었습니다.

Protocol

참고: 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 기관의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에서 기술된 연구는 SRI 인터내셔널의 IACUC에 의해 수립된 지침에 따라 수행되었습니다. 1. LOX 결핍 마우스의 획득 및 유지 보수 5-LOX 결핍 또는 12/15-LOX-결핍 마우스와 7-8 주에 각각의 변형 및 성일치 제어를 구입…

Representative Results

이 독소 노출 패러다임은 MPTP- 대 식염수 주입 동물에서 중요하고 검출 가능한 20% 현저도 도파민 고갈을 생성할 수 있습니다. MPTP의 다른 제비는 약간 더 많거나 적은 병변을 얻을 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다; 따라서, 더 나은 정밀도를 위해, 신경 독소의 새로운 제비가 이용될 때 형질전환에서 사용하기 전에 야생형 마우스에 있는 예비 실험은 추천됩니다. 온화한 병변의 사용은 간?…

Discussion

이 유전자 환경 상호 작용 연구의 디자인은 우리가 nigrostriatal 통로에 있는 5-LOX isozyme의 이중 본질에 관하여 새로운 정보를 얻기 위하여 허용했습니다. 5-LOX 이소지메와 그들의 야생형 쓰레기메이트가 결핍된 형질 성 전환기에서 식염수 또는 MPTP 처리 후에 striatal monoamines를 측정하기 위하여 HPLC를 수행해서, 우리는 그것의 결핍이 독성 조건하에서 보호되는 것처럼 보인다는 것을 주의할 수 있었습?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 건강 NIGMS 056062의 국가 학회에 의해 투자되었다.

Materials

1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01  counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt  7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) – 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
[header]
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
[header]
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778
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References

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Keywords: Gene-environment InteractionLipoxygenaseParkinson’s DiseaseMPTPNeurodegenerative DisordersNigrostriatal DegenerationDopamineTyrosine HydroxylaseInflammationGFAPIba-1
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Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson’s Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).
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