Fremstilling af Hydroxy-PAAM hvdroqeler for afkobling virkningerne af Mechanotransduction Cues
Summary
Vi præsenterer en ny polyacrylamidhydrogel, kaldet hydroxy-PAAM, der tillader en direkte binding af ECM-proteiner med minimale omkostninger eller ekspertise. Kombinationen af hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact udskrivning letter uafhængig styring af mange tidskoder af den naturlige celle mikromiljø for at studere cellulær mechanostransduction.
Abstract
Det er nu veletableret, at mange cellulære funktioner reguleres af interaktioner af celler med fysisk-kemiske og mekaniske tidskoder af deres ekstracellulære matrix (ECM) miljø. Eukaryote celler fornemmer hele tiden deres lokale mikromiljø gennem overfladen mechanosensors at transducere fysiske ændringer af ECM i biokemiske signaler, og integrere disse signaler for at opnå specifikke ændringer i genekspression. Interessant, at fysisk-kemiske og mekaniske parametre ECM kan par med hinanden regulere celleskæbnen. Derfor er en nøgle til forståelse mechanotransduction er at afkoble relative bidrag ECM tidskoder på cellulære funktioner.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol til hurtigt og nemt generere biologisk relevante hydrogeler til den uafhængige tuning af mechanotransduction stikord in vitro. Vi kemisk modificerede polyacrylamid hydrogeler (PAAM) for at overvinde de fra naturens hånd ikke-ADHESive egenskaber ved at inkorporere hydroxyl-funktionaliseret acrylamidmonomerer under polymerisationen. Vi opnåede en roman PAAM hydrogel, kaldet hydroxy-PAAM, som tillader immobilisering af enhver ønsket art af ECM-proteiner. Kombinationen af hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact udskrivning giver mulighed for selvstændigt at styre morfologi af enkelt-celler, matrix stivhed, arten og tætheden af ECM-proteiner. Vi giver en enkel og hurtig metode, der kan sættes op i hver biologi laboratorium til at studere in vitro celle mechanotransduction processer. Vi validerer denne roman todimensionale platform ved at foretage eksperimenter på endotelceller, der viser en mekanisk kobling mellem ECM stivhed og kernen.
Introduction
Mange aspekter af den lokale cellulære mikromiljø (f.eks stivhed, porestørrelse, natur af proteiner eller celle-ligand-densitet) give en koordinat sæt af regulatoriske signaler, der styrer cellulære processer såsom motilitet, celleproliferation, differentiering og genekspression. Modifikationer af de fysisk-kemiske egenskaber af det ekstracellulære miljø kan opfattes af celler og forårsage forskellige fysiologiske konsekvenser, herunder deformation af cellulær polarisering, migration og differentiering. Det forbliver imidlertid uklart, hvordan celler oversætte ECM ændringer i cellulære biokemiske signaler. Det er derfor af stor betydning at konstruere kontrolleret in vitro mikromiljøer, der kan gengive samspillet mellem celler og deres mikromiljø for at studere mechanotransduction veje. For at løse dette problem, har vi for nylig indført en ny metode 1, kaldet hydroxy-PAAM hydrogeler, til nemt at generere to-dimennsional bløde matricer, der tillader til selvstændigt at styre vigtige mechanotransduction stikord: matrix stivhed, celle geometri og indeslutning, art af de proteiner og celle-liganddensitet.
ECM dirigerer cellulære processer via gradienter i morfogener (kemotaksis), klæbende proteiner (haptotaxis) og stivhed (durotaxis). I de seneste årtier har avanceret in vitro-platforme er blevet udviklet til at isolere disse ekstracellulære signaler for at drille ud af, hvordan celler er i stand til at oversætte biokemiske og biofysiske egenskaber i fysiologiske processer 2-5. Elektronstråle 6 fotolitografi 7, fotokemisk immobilisering 8 eller plasma-assisteret teknikker 9 er blevet udviklet til at styre væksten af levende celler på mikromønstrede substrater. Selv om disse teknikker har givet vigtige resultater, de fleste af dem ikke tillade forskelsbehandling mellem den enkelte indflydelse forskellige tidskoder på celle adfærdog de kræver tekniske faciliteter at få laboratorier kan betale. Blandt disse teknikker, microcontact udskrivning (μCP), har vist sig som en robust og tilgængelig metode til at skabe celle-klæbende mikro-øerne 10. For nylig har en omfattende indsats 11-14 blevet gjort for at udvikle μCP på hydrogeler med justerbare stivheder for at reproducere den brede vifte af stivheder observeret i levende væv. Blandt disse værker har polyacrylamid (PAAM) blevet populær 15 og er allerede en af de mest almindeligt anvendte polymer-baserede matricer til celle biomekanik assays.
PAAM overflader er almindeligt funktionaliseret med den heterobifunktionelle krydsbinder N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) og ECM-proteiner er bundet til overfladen ved UV-aktivering af sulfo-SANPAH nitrophenyl azidgrupper 16. En anden teknik består i kobling hydrazin til proteiner, der er blevet alvorligt oxideretmed periodat 17. Hynd og medarbejdere indført en teknik til mønstring biomimetiske hydrogel overflader med protein og peptider, som kræver fotopolymerisation i nærvær af en acroyl streptavidin monomer 18. Mere for nylig, Tseng et al. Har rapporteret en ny micropatterning metode 19 baseret på dyb UV-eksponering af PAAM gennem en optisk kvarts maske, der kræver at inkubere aktiverede PA geler med 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) og N-hydroxysuccinimid (NHS) vandopløsninger forud at tilføje proteinet. Trods evnen af disse teknikker til at skabe ensartede og reproducerbare proteiner micropatterns, de fleste af dem lider store begrænsninger: lang syntese processer (fx dialyse, lyofilisering, etc.), dyre kemiske forbindelser (f.eks hyaluronsyre, sulfo-SANPAH) eller dyb UV bestråling. Hertil kommer, at disse teknikker ikke give uafhængige modulering af substrat stivhed, micropatterngeometri, ECM protein natur, og celle-liganddensitet.
Under disse begrænsninger i betragtning, har vi udviklet en ny og enkel acrylamid-baserede tilgang, der tillader immobilisering af en række proteiner og biomolekyler på bløde hydrogeler og tillader uafhængig tuning af mechanotransduction stikord for at dechifrere deres rolle på cellulære funktioner. I stedet for at behandle PAAM hydrogeler med skrappe kemiske forbindelser, introducerer vi en kommerciel acrylamidmonomer med hydroxylgrupper løbet PAAM polymerisation. Denne enkle betjening overvinder den iboende anti-klæbende egenskab af PAAM hydrogeler uden andre tekniske krav.
Tilstedeværelsen af hydroxylgrupper fører til en høj affinitet hydroxy-PAAM hydrogeler til proteiner og biomolekyler, der danner hydrogenbindende interaktioner. I kombination med μCP, hydroxy-PAAM hydrogeler muliggør en hurtig generering af to-dimensionelle kultur platform med en uafhængig kontrolpå matrix-stivhed, type ECM-proteiner, celle-liganddensitet og begrænses klæbeevne, der er forudset til at være en stærk platform for at studere mechanotransduction.
Formålet med denne protokol er at give de nødvendige oplysninger til nemt gør hydroxy-PAAM hydrogeler uden nogen form for ekspertise i materialevidenskab. Det ultimative mål er at give et middel for forskere til at stille fysiologisk relevante spørgsmål på de cellulære og væv niveauer, der kan føre til en bedre forståelse af mechanotransduction veje involveret i patofysiologiske mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange in vitro-observationer i moderne cellebiologi er blevet udført på stive dækglas, ofte belagt med et tyndt lag af ECM-proteiner eller syntetiske peptider, der indeholder RGD-sekvensen. Men sådanne grundlæggende kultur substrater ikke rekapitulere hele fysisk-kemiske kompleksitet ECM og dermed ikke give en nøjagtig model til at studere cellulære mechanotransduction processer. For at løse dette problem foreslår vi et simpelt alternativ til funktionalisere todimensionale hydrogeler med enhver ønsket…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol “ink” followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material’s perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
