Подготовка гидрокси-PAAM Гидрогели расцепления последствий механотрансдукции сцен
Summary
Мы представляем новый полиакриламидного гидрогеля, называемый гидрокси-PAAM, что позволяет прямое связывание белков ЕСМ с минимальными затратами или экспертизы. Сочетание гидрокси-PAAM гидрогели с микроконтактная печать облегчает независимый контроль многих киев естественного микроокружения клеток для изучения клеточного mechanostransduction.
Abstract
В настоящее время хорошо известно, что многие клеточные функции регулируются взаимодействия клеток с физико-химическими и механическими киев их внеклеточного матрикса (ECM) среды. Эукариотические клетки постоянно ощущать свою локальную микросреду через поверхностные механосенсоров преобразовывать физические изменения ECM в биохимических сигналов, и интегрировать эти сигналы для достижения конкретных изменений в экспрессии генов. Интересно, что физико-химические и механические параметры ЭСУД может пару друг с другом, чтобы регулировать судьбы клеток. Поэтому, ключ к пониманию механотрансдукции является разделение относительный вклад ECM киев на клеточных функций.
Здесь мы представляем подробный протокол эксперимента, чтобы быстро и легко создавать биологически активные гидрогели для самостоятельного тюнинга механотрансдукции киев в пробирке. Мы химически модифицированные полиакриламидные гидрогели (PAAM) преодолеть их внутренне не-adhesив свойства от включения гидроксильные-функционализированных мономеров акриламида в процессе полимеризации. Мы получили новый PAAM гидрогель, который называется гидрокси-PAAM, который позволяет иммобилизацию любого желаемого характера белков ЕСМ. Сочетание гидрокси-PAAM гидрогелей с микроконтактной печати позволяет независимо управлять морфологию отдельных клеток, матрица жесткости, характер и плотность белков ЕСМ. Мы предоставляем простой и быстрый метод, который может быть установлен в любой лаборатории биологии для изучения в пробирке процессов клеточной механотрансдукции. Мы проверки этого романа двумерный платформу путем проведения экспериментов на эндотелиальных клетках, которые демонстрируют механическое соединение между ECM жесткости и ядра.
Introduction
Многие аспекты местной сотовой микроокружения (например, жесткость, размер пор, природа белков, или плотность клеток-лиганд) обеспечивают координатное множество регулирующих сигналов, которые контролируют клеточные процессы, такие как подвижность, клеточной пролиферации, дифференцировки и экспрессии генов. Модификации физико-химических свойств внеклеточной среде может быть воспринята клеток и вызывает различные физиологические последствия, в том числе деформации клеточной поляризации, миграции, и дифференциации. Остается неясным, однако, как клетки перевести ECM изменения в клеточных биохимических сигналов. Поэтому большое значение для инженера контролируется в пробирке микросреды, которые могут воспроизводить взаимодействия между клетками и их микросреды для изучения механотрансдукции пути. Для решения этой проблемы, мы недавно ввели новый способ 1, под названием гидрокси-PAAM гидрогели, легко генерировать два-копейкиnsional мягкие матрицы, которые позволяют независимо управлять важные сигналы механотрансдукции: матрица жесткости, геометрия клеток и удержания, природа белка и плотности клеток-лиганд.
ECM направляет клеточные процессы через градиентов в морфогенов (хемотаксиса), клейкие белки (haptotaxis) и жесткость (durotaxis). За последние несколько десятилетий, расширенный в платформах пробирке были разработаны, чтобы изолировать эти внеклеточные сигналы для того, чтобы дразнить, как клетки способны перевести биохимические и биофизические особенности в физиологических процессов 2-5. Электронно-лучевое 6, 7 фотолитографии, фотохимическое иммобилизации 8, или методы с помощью плазмы 9 были разработаны, чтобы направить рост живых клеток на micropatterned субстратов. Хотя эти методы были получены важные результаты, большинство из них не позволяют различить индивидуального влияния различных сигналов на поведение клетоки они требуют технических средств, что несколько лабораторий могут себе позволить. Среди этих методов, микроконтактная печати (μCP), стала надежной и доступным методом для создания клеточных-клей микро-острова 10. Совсем недавно, обширные усилия 11-14 были сделаны в разработке μCP на гидрогели с перестраиваемой жесткости для того, чтобы воспроизвести широкий спектр жесткости наблюдаемых в живых тканях. Среди этих работ, полиакриламид (PAAM) стала популярной 15 и уже является одним из наиболее часто используемых матриц на основе полимеров для сотовых биомеханики анализов.
PAAM поверхности, как правило, функционализированные с гетеробифункциональным сшивающим агентом N-сульфосукцинимидил-6-[4'-азидо-2'-nitrophenylamido] (сульфо-SANPAH) и ECM белки, связанного с поверхностью с помощью УФ активации сульфо-нитрофенил SANPAH азидные группы 16. Другой метод состоит в связи гидразина к белкам, которые были сильно окисленногоперйодатом 17. Хинд и его коллеги ввели технику рисунка биомиметических гидрогелевые поверхностей с белком и пептидов, которая требует фотополимеризации в присутствии acroyl-стрептавидин мономера 18. Совсем недавно, Tseng и соавт. Сообщали новый метод micropatterning 19 на основе глубокого УФ-облучения PAAM через оптическую маску кварцевого, которое требует, чтобы инкубировать активированные PA гели с 1-этил-3- [3-диметиламинопропил-] карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) водные растворы до добавить белок. Несмотря на способность этих методов для создания однородных и воспроизводимых белки micropatterns, большинство из них страдают основные ограничения: долго синтеза процессов (например, диализ, лиофилизации и т.д.), дорогие химические соединения (например, гиалуроновая кислота, сульфо-SANPAH) или глубокий УФ облучения. Кроме того, эти методы не позволяют независимую модуляцию подложки жесткости, micropatternгеометрии, ЕСМ белковой природы, а плотность клеток-лиганд.
Принимая эти ограничения во внимание, мы разработали новый и простой основе акриламида подход, позволяющий иммобилизации различных белков и биомолекул на мягких гидрогелей и разрешает независимую настройку механотрансдукции киев для того, чтобы расшифровать их роль в клеточных функций. Вместо того чтобы рассматривать PAAM гидрогели с резкими химических соединений, введем коммерческую акриламида мономера с гидроксильных групп во время полимеризации PAAM. Эта простая операция преодолевает внутреннюю антиадгезивной свойство PAAM гидрогели без любых других технических требований.
Наличие гидроксильных групп приводит к высоким сродством гидрокси-PAAM гидрогелей для белков и биомолекул, которые образуют водородные связи взаимодействия. В сочетании с μCP, гидрокси-PAAM гидрогели способствующих быстрому поколение двумерной платформы культуры с независимым контролемна матрицы жесткости, типа белков ЕСМ, плотность клеток-лиганд и ограниченном клейкости, которые предусмотренном быть мощной платформой для изучения механотрансдукции.
Цель этого протокола заключается в предоставлении необходимой информации для легко сделать гидроксильные-PAAM гидрогели без экспертизы в области материаловедения. Конечной целью является, чтобы обеспечить средства для исследователей спросить физиологически соответствующие вопросы на клеточном и тканевом уровнях, что может привести к лучшему пониманию механотрансдукции путей, участвующих в патофизиологических механизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многие в пробирке наблюдений в современной клеточной биологии были выполнены на жестких покровные стекла, часто покрытых тонким слоем ECM белков или синтетических пептидов, содержащих последовательность RGD. Однако такие основные культуры субстраты не резюмировать всю сложность ф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol “ink” followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material’s perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
