Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões
Summary
Apresentamos um novo hidrogel de poliacrilamida, chamada hidroxi-PAAm, que permite uma ligação direta das proteínas da MEC com custo ou experiência mínima. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact facilita o controlo independente das muitas pistas de o microambiente celular natural para estudar mechanostransduction celular.
Abstract
Está agora bem estabelecido que muitas funções celulares são reguladas por interacções de células com pistas físico-químicas e mecânicas do seu ambiente de matriz extracelular (ECM). As células eucarióticas sentir constantemente seu microambiente local através mechanosensors de superfície para a transdução de mudanças físicas de ECM em sinais bioquímicos, e integrar esses sinais para alcançar mudanças específicas na expressão gênica. Curiosamente, os parâmetros físico-químicas e mecânicas do casal ECM lata uns com os outros para regular o destino celular. Portanto, a chave para a compreensão Mecanotransdução é dissociar a contribuição relativa dos sinais de ECM sobre as funções celulares.
Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para gerar rapidamente e facilmente hidrogéis biologicamente relevantes para a afinação independente de pistas Mecanotransdução in vitro. Nós, os hidrogéis de poliacrilamida quimicamente modificados (Paam) para ultrapassarem as suas intrinsecamente não-Adhesive propriedades, incorporando monómeros de acrilamida funcionalizado com hidroxilo, durante a polimerização. Obtivemos um romance PAAm hidrogel, chamado hidroxi-PAAm, que permite a imobilização de qualquer natureza desejada das proteínas da MEC. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact permite controlar de forma independente a morfologia das células individuais, a rigidez da matriz, a natureza e a densidade das proteínas da MEC. Nós fornecemos um método simples e rápido que pode ser configurado em cada laboratório de biologia para estudar em processos Mecanotransdução células in vitro. Nós validar este romance plataforma bidimensional através da realização de experimentos em células endoteliais que demonstram uma ligação mecânica entre rigidez ECM eo núcleo.
Introduction
Muitos aspectos do microambiente celular local (por exemplo, rigidez, tamanho de poro, a natureza das proteínas, ou a densidade de célula-ligando) fornecer um conjunto de coordenadas de sinais de regulação que controlam os processos celulares tais como a motilidade, a proliferação celular, diferenciação, e a expressão do gene. As modificações das propriedades físico-químicas do ambiente extracelular pode ser percebida por células e provocar consequências fisiológicas diferentes, incluindo deformação da polarização celular, migração, e diferenciação. Ainda não está claro, no entanto, como as células traduzir modificações ECM em sinais bioquímicos celulares. Por isso, é de grande importância para engenheiro controlado em microambientes in vitro que podem reproduzir as interações entre células e seu microambiente para estudar vias Mecanotransdução. Para resolver este problema, que recentemente introduziu um novo método 1, chamado de hidrogéis-PAAm hidroxi, para gerar facilmente de dois centavomatrizes nsional suaves que permitem controlar de forma independente pistas Mecanotransdução importantes: a rigidez da matriz, geometria celular e confinamento, da natureza da proteína e densidade de células-ligante.
MEC orienta processos celulares através de gradientes em morphogens (quimiotaxia), proteínas adesivas (haptotaxia) e rigidez (durotaxis). Ao longo das últimas décadas, avançado em plataformas in vitro têm sido desenvolvidos para isolar esses sinais extracelulares, a fim de trazer à tona como as células são capazes de traduzir características bioquímicas e biofísicas em processos fisiológicos 2-5. Foram desenvolvidos por feixe de elétrons 6, 7 fotolitografia, imobilização fotoquímica de 8, ou técnicas assistidos por plasma 9 para dirigir o crescimento de células vivas nos substratos micropatterned. Embora essas técnicas tiveram resultados importantes, a maioria deles não permitem a discriminação entre a influência individual de diferentes pistas sobre o comportamento das célulase requerem instalações técnicas que alguns laboratórios podem pagar. Entre estas técnicas, a impressão microcontact (μCP), tem surgido como um método robusto e acessível para a criação de células-adesiva micro-ilhas 10. Mais recentemente, os esforços extensos 11-14 foram feitos para desenvolver hidrogéis com μCP em rigidez ajustáveis, a fim de reproduzir a vasta gama de rigidez observados em tecidos vivos. Entre essas obras, poliacrilamida (PAAm) tornou-se popular 15 e já é uma das matrizes à base de polímeros mais utilizados para estudos biomecânicos celulares ensaios.
PAAm superfícies são geralmente funcionalizada com o agente de reticulação heterobifuncional proteínas-sulfossuccinimidil-6-N [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) e de ECM são ligados à superfície através da activação de UV do nitrofenil sulfo-SANPAH grupos azida 16. Uma outra técnica consiste no acoplamento de hidrazina para proteínas que têm sido severamente oxidadocom periodato 17. Hynd e colaboradores introduzida uma técnica para padronizar as superfícies de hidrogel biomiméticos com proteínas e peptídeos que requer a fotopolimerização na presença de um monómero acroyl-estreptavidina 18. Mais recentemente, Tseng et al. Relataram um novo método micropatterning 19 com base na exposição à radiação UV profunda de PAAm através de uma máscara de quartzo óptico que requer a incubar geles PA activado com 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e soluções aquosas de N-hidroxissuccinimida (NHS) antes de adicionar a proteína. Apesar da capacidade destas técnicas para criar proteínas homogéneas e reprodutíveis micropadrões, a maior parte deles sofrem grandes limitações: os processos de síntese de longo (por exemplo, a diálise, liofilização, etc), compostos químicos caros (por exemplo, ácido hialurónico, sulfo-SANPAH) ou UV profundo irradiação. Além disso, estas técnicas não permitem a modulação independente de rigidez do substrato, micropatterngeometria, ECM natureza proteica, e a densidade celular-ligando.
Tendo em conta estas limitações, temos desenvolvido uma abordagem base de acrilamida e novos simples que permite a imobilização de uma variedade de proteínas e biomoléculas em hidrogéis macios e permite sintonia independente de sinais Mecanotransdução a fim de decifrar o seu papel em funções celulares. Em vez de tratar hidrogéis PAAm com compostos químicos agressivos, introduzimos um monômero acrilamida comercial com grupos hidroxila durante a polimerização PAAm. Esta operação simples supera a propriedade anti-aderente intrínseca de hidrogéis PAAm sem quaisquer outros requisitos técnicos.
A presença de grupos hidroxilo conduz a uma elevada afinidade de hidrogéis PAAm-hidroxi para proteínas e biomoléculas que formam interacções hidrogénio por entrelaçamento. Em combinação com μCP, hidrogéis-hidroxi PAAm permitir a rápida geração de plataforma cultura bidimensional com um controlo independentesobre a rigidez da matriz, o tipo de proteínas de ECM, a densidade celular ligando-confinado e adesividade, que está previsto para ser uma plataforma poderosa para o estudo Mecanotransdução.
O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a tomada facilmente hidrogéis-PAAm hidroxi sem qualquer experiência em ciências de materiais. O objetivo final é fornecer um meio para que os pesquisadores fazem perguntas fisiologicamente relevantes nos níveis celulares e teciduais que podem levar a uma melhor compreensão das vias Mecanotransdução envolvidas em mecanismos fisiopatológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos em observações in vitro em moderna biologia celular ter sido realizada em lamelas de vidro rígidas, muitas vezes revestidos com uma fina camada de proteínas de ECM ou de péptidos sintéticos contendo a sequência RGD. No entanto, tais substratos de cultura básicos não recapitular toda a complexidade físico-química da ECM e, portanto, não fornecem um modelo exato para o estudo de processos Mecanotransdução celulares. Para resolver este problema, propomos uma alternativa simples para f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
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