Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues
Summary
Vi presentiamo un nuovo idrogel di poliacrilamide, chiamato idrossi-PAAM, che permette un legame diretto di proteine ECM con un costo minimo o esperienza. La combinazione di idrossi-PAAM Idrogel con stampa microcontact facilita il controllo indipendente di molti spunti del microambiente naturale delle cellule per studiare mechanostransduction cellulare.
Abstract
E 'ormai ben noto che molte funzioni cellulari sono regolate da interazioni delle cellule con spunti fisico-chimiche e meccaniche della loro matrice extracellulare (ECM) ambiente. Le cellule eucariotiche sentono costantemente il loro microambiente locale attraverso meccanosensori superficie di trasdurre i cambiamenti fisici di ECM in segnali biochimici, e integrare questi segnali per raggiungere specifici cambiamenti nell'espressione genica. È interessante notare che i parametri fisico-chimiche e meccaniche della coppia ECM lattina con l'altro per regolare destino cellulare. Pertanto, una chiave per comprendere meccanotrasduzione è quello di disaccoppiare il contributo relativo di spunti ECM sulle funzioni cellulari.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato sperimentale per generare rapidamente e facilmente idrogel biologicamente rilevanti per la messa a punto indipendente di spunti meccanotrasduzione in vitro. Noi idrogel di poliacrilamide modificati chimicamente (PAAM) per superare i loro intrinsecamente non ADHESive proprietà incorporando monomeri di acrilammide idrossile-funzionalizzati durante la polimerizzazione. Abbiamo ottenuto un romanzo PAAM idrogel, chiamato idrossi-PAAM, che consente l'immobilizzazione di qualsiasi natura desiderato di proteine ECM. La combinazione di idrossi-Paam Idrogel con stampa microcontact permette di controllare indipendentemente la morfologia delle cellule singole, la rigidità della matrice, la natura e la densità delle proteine ECM. Mettiamo a disposizione un metodo semplice e rapido che può essere impostato in ogni laboratorio di biologia per studiare nei processi meccanotrasduzione cellule in vitro. Abbiamo convalidare questo romanzo piattaforma bidimensionale conducendo esperimenti sulle cellule endoteliali che dimostrano un accoppiamento meccanico tra ECM rigidità e il nucleo.
Introduction
Molti aspetti del microambiente cellulare locale (ad esempio, la rigidità, dimensione dei pori, la natura delle proteine, o di densità delle cellule-ligando) forniscono una serie coordinata di spunti normativi che controllano processi cellulari come la motilità, proliferazione cellulare, differenziamento, e l'espressione genica. Le modifiche delle proprietà fisico-chimiche dell'ambiente extracellulare possono essere percepiti dalle cellule e causare diverse conseguenze fisiologiche, tra cui la deformazione della polarizzazione cellulare, la migrazione e la differenziazione. Non è chiaro, tuttavia, come le cellule traducono ECM modifiche in segnali biochimici cellulari. E 'quindi di grande importanza per Ingegnere controllata in microambienti in vitro in grado di riprodurre le interazioni tra cellule e il loro microambiente per studiare percorsi meccanotrasduzione. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente introdotto un nuovo metodo 1, chiamato idrogel-PAAM idrossi, di generare facilmente due dimematrici nsional morbidi che permettono di controllare in modo indipendente importanti spunti meccanotrasduzione: rigidezza, matrice di geometria cellulare e confinamento, la natura delle proteine e densità cellulare-ligando.
ECM dirige processi cellulari attraverso gradienti in morphogens (chemiotassi), proteine adesive (haptotaxis) e rigidità (durotaxis). Nel corso degli ultimi decenni, avanzata in piattaforme vitro sono stati sviluppati per isolare questi segnali extracellulari, al fine di prendere in giro fuori come le cellule sono in grado di tradurre le caratteristiche biochimiche e biofisiche in processi fisiologici 2-5. Sono stati sviluppati a fascio elettronico 6, fotolitografia 7, 8 immobilizzazione fotochimico o tecniche plasma assistita 9 per dirigere la crescita delle cellule viventi su substrati micropatterned. Anche se queste tecniche hanno dato risultati importanti, la maggior parte di essi non consentono una discriminazione tra l'influenza individuale di diversi spunti sul comportamento delle cellulee richiedono attrezzature tecniche che pochi laboratori possono permettersi. Tra queste tecniche, stampa microcontact (μCP), è emerso come un metodo affidabile e accessibile per creare cellule-adesivo micro-isole 10. Più di recente, grandi sforzi 11-14 sono stati fatti per sviluppare μCP su idrogel con rigidità accordabili in modo da riprodurre la vasta gamma di rigidità osservati nei tessuti viventi. Tra queste opere, poliacrilammide (PAAM) è diventata popolare 15 ed è già una delle matrici a base di polimeri più comunemente usati per la biomeccanica cellulari saggi.
Superfici Paam sono comunemente funzionalizzati con il eterobifunzionale reticolante N-sulfosuccinimidyl-6-proteine [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (solfo-SANPAH) e ECM sono legati alla superficie mediante attivazione UV del nitrofenil solfo-SANPAH gruppi azide 16. Un'altra tecnica consiste nel idrazina accoppiamento a proteine che sono stati gravemente ossidaticon periodato 17. Hynd e collaboratori hanno introdotto una tecnica per patterning di superfici idrogel biomimetici con proteine e peptidi che richiede fotopolimerizzazione in presenza di un monomero acroyl-streptavidina 18. Più recentemente, Tseng et al. Hanno segnalato un nuovo metodo micropatterning 19 sulla base dell'esposizione ai raggi UV profondo di PAAM attraverso una maschera di quarzo ottico che richiede di incubare gel PA attivati con 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N-idrossisuccinimmide (NHS) soluzioni di acqua prima di aggiungere la proteina. Nonostante la capacità di queste tecniche per creare omogenei e riproducibili proteine microdisegni, la maggior parte di loro soffrono maggiori limitazioni: processi lunghi di sintesi (ad esempio, dialisi, liofilizzazione, ecc), composti chimici costosi (ad esempio, l'acido ialuronico, solfo-SANPAH) o UV profondo irradiazione. Inoltre, queste tecniche non consentono la modulazione indipendente substrato rigidità, micropatterngeometria, ECM natura proteica, e la densità delle cellule-ligando.
Prendendo queste limitazioni in considerazione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio e semplice a base di acrilammide, che consente l'immobilizzazione di una varietà di proteine e biomolecole su idrogel morbido e permette la sintonizzazione indipendente di spunti meccanotrasduzione al fine di decifrare il loro ruolo sulle funzioni cellulari. Invece di trattare idrogel PAAM con composti chimici aggressivi, introduciamo un monomero acrilammide commerciale con gruppi idrossilici PAAM durante la polimerizzazione. Questa semplice operazione supera la proprietà anti-adesive intrinseca degli idrogel PAAM senza altri requisiti tecnici.
La presenza di gruppi ossidrilici porta ad una elevata affinità di idrogel-idrossi Paam per proteine e biomolecole che formano interazioni di idrogeno-bonding. In combinazione con μCP, idrogel-PAAM idrossi consentono una rapida generazione di piattaforma cultura bidimensionale con un controllo indipendentesulla rigidità matrice, tipo di proteine ECM, densità cellulare-ligando e adesività limitata, che si immaginava di essere una potente piattaforma per lo studio meccanotrasduzione.
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per rendere facilmente idrogel-PAAM idrossi senza alcuna competenza in scienze dei materiali. L'obiettivo finale è quello di fornire un mezzo per i ricercatori di porre domande fisiologicamente rilevanti a livello cellulare e dei tessuti che possono portare ad una migliore comprensione delle vie meccanotrasduzione coinvolti nei meccanismi fisiopatologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molte osservazioni in vitro nella moderna biologia cellulare sono state eseguite su vetrini rigidi, spesso rivestiti con un sottile strato di proteine ECM o peptidi sintetici contenenti la sequenza RGD. Tuttavia, tali substrati di coltura di base non ricapitolano l'intera complessità fisico-chimiche della ECM e quindi non forniscono un modello accurato per lo studio dei processi meccanotrasduzione cellulari. Per affrontare questo problema, vi proponiamo una semplice alternativa a funzionalizzare idro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
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