mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조
Summary
우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.
Abstract
그것은 지금 잘 많은 세포 기능은 자신의 세포 외 기질 (ECM) 환경의 물리 화학적 및 기계적 신호와 세포의 상호 작용에 의해 조절되는 것으로 설정됩니다. 진핵 세포는 지속적으로 생화학 적 신호로 ECM의 물리적 변화를 형질 도입하기 위해 표면 mechanosensors 통해 로컬 미세 환경을 감지하고, 유전자 발현의 특정 변화를 달성하기 위해 이러한 신호를 통합. 흥미롭게도, 서로 ECM 캔 부부의 물리 화학적 및 기계적 매개 변수는 세포의 운명을 조절합니다. 따라서, mechanotransduction의를 이해하는 열쇠는 세포 기능에 ECM 큐의 상대적 기여도를 분리하는 것입니다.
여기에서 우리는 신속하고 쉽게 체외에서 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을위한 생물학적으로 관련 하이드로 겔을 생성하는 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 화학적으로 변성 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔 (PAAm)는 자신의 본질적 비 ADHES을 극복하기중합시 히드 기능화 아크릴 모노머를 포함함으로써 속성 필자. 우리는 ECM 단백질의 원하는 성질의 고정화를 허용 록시-PAAm 불리는 신규 PAAm 하이드로 겔을시켰다. 마이크로 콘택트 프린팅은 독립적으로 단일 세포의 형태학, 매트릭스 강성 및 자연 ECM 단백질의 농도를 제어 할 수 있도록하여 하이드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔. 우리는 시험 관내 세포 mechanotransduction의 과정에서 공부하는 모든 생물학 실험실에서 설정할 수있는 간단하고 빠른 방법을 제공한다. 우리는 ECM의 강성과 핵 사이의 기계적 커플 링을 보여 내피 세포에 대한 실험을 실시하여이 소설 두 차원 플랫폼을 검증합니다.
Introduction
지방 세포의 미세 환경의 많은 부분 (예를 들면, 강도, 기공 크기, 단백질의 성질, 또는 세포 리간드 밀도)가 이러한 운동성, 세포 증식, 분화 및 유전자 발현과 같은 세포 과정을 조절 규제 큐들의 좌표를 제공한다. 세포 외 환경의 물리 화학적 특성의 수정은 세포에 의해 감지 및 세포 편광, 마이그레이션 및 분화의 변형 등 다양한 생리 학적 결과를 야기 할 수 있습니다. 그것은 세포가 세포 생화학 적 신호로 ECM 수정을 번역하는 방법을, 그러나 확실하지 않다. 따라서 주요 중요성 mechanotransduction의 경로를 공부 셀과 미세 환경 사이의 상호 작용을 재현 할 수있는 시험 관내 미세 환경 제어 엔지니어이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근에 쉽게 두 푼을 생성하기 위해, 히드 록시 PAAm 하이드로 겔이라는 새로운 방법 하나를 소개했다nsional 소프트 독립적으로 중요한 mechanotransduction의 단서를 제어 할 수 있도록 매트릭스 : 매트릭스 강성, 셀 형상과 감금, 단백질 및 세포 리간드 밀도의 자연입니다.
ECM은 morphogens에서 그라디언트를 통해 세포 과정 (화성), 접착 단백질 (haptotaxis), 강성 (durotaxis)을 지시합니다. 지난 몇 년 동안, 시험관 플랫폼에서 첨단 세포 생리 프로세스 2-5로 생화학 및 생물 물리학 적 기능을 변환 할 수있는 방법을 애타게하기 위해 이러한 세포 외 신호를 분리하기 위해 개발되었다. 전자빔 (6), (7), 포토 리소그래피, 광 화학적 고정화 8 또는 플라즈마 – 보조 기술도 9는 기판 상에 미세 패턴 살아있는 세포의 성장을 유도하기 위해 개발되었다. 이러한 기술이 중요한 결과를 산출하고 있지만, 이들 중 대부분은 세포 행동에 상이한 큐들의 개별적인 영향 사이의 차별을 허용하지그들은 몇 가지 실험실이 감당할 수있는 기술 설비를 필요로한다. 이러한 기술 중 미세 접촉 인쇄 (μCP)는 세포 접착 마이크로 섬 열을 만들 수있는 강력하고 접근 가능한 방법으로 떠오르고있다. 최근에, 광범위한 노력 11-14은 생체 조직에서 관찰 강성의 넓은 범위를 재현하기 위해 가변 강성과 하이드로 겔에 μCP을 개발되었습니다. 이들 작업 중, 폴리 아크릴 아미드 (PAAm)는 15 대중적 이미 세포 생체 역학 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 중합 체계 매트릭스 중 하나입니다.
PAAm 표면은 일반적으로 N-sulfosuccinimidyl -6- [4'-아지도-2'-nitrophenylamido] (술포 SANPAH) 및 ECM 단백질 술포 SANPAH의 니트로의 UV 활성화함으로써 표면으로 연결되어 헤테로 가교제로 작용된다 아 지드 그룹 16. 또 다른 기술은 심한 산화 된 단백질에 결합 히드라진에 이루어져요오드 17. Hynd 및 동료 acroyl – 스트렙 타비 딘 단량체 (18)의 존재 광중합을 필요로 단백질과 펩타이드 생체 모방 하이드로 겔 표면을 패터닝하는 기술을 소개했다. 최근 챙은 외. 일 에틸 3 – [3 – 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드로 활성화 된 PA 젤을 배양하는 데 필요한 광학 석영 마스크를 통해 PAAm 깊은 UV 노출에 기초한 새로운 미세 가공 방법 19 (EDC)를보고했다 및 N-히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 수용액 전에 단백질을 추가한다. 긴 합성 과정 (예, 투석, 동결 건조, 등), 비싼 화학 물질 (예를 들면, 히알루 론산, 술포 SANPAH) 또는 깊은 UV : 균일하고 재현성 단백질 미세 패턴을 생성하기 위해 이러한 기술의 능력에도 불구하고, 대부분의 주요 한계 고통 조사. 또한, 이들 기술은 강성 기판, 미세 패턴의 독립적 인 변조를 허용하지 않는다기하학, ECM 단백질 자연, 그리고 세포 리간드 밀도.
계정에 이러한 한계를 가지고 가서, 우리는 부드러운 하이드로 겔의 단백질 및 생체 분자의 다양한 고정 수 및 세포 기능에 미치는 역할을 해독하기 위해 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을 허용하는 새롭고 간단한 아크릴 아미드 기반의 접근 방식을 개발했다. 대신에 강한 화학 화합물 PAAm 하이드로 겔을 치료, 우리 PAAm 중합 중에 수산기와 상업용 아크릴 모노머를 도입. 이 간단한 조작으로 다른 기술적 요구 사항없이 PAAm 하이드로 겔의 고유 안티 – 접착 성을 극복한다.
수산기의 존재는 수소 결합 상호 작용을 형성하는 단백질 및 생 분자를위한 히드 록시 PAAm 하이드로 겔의 높은 친화력으로 이끈다. μCP와 함께, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔은 독립 제어와 이차원 배양 플랫폼의 신속한 생성을 가능하게mechanotransduction의 연구를위한 강력한 플랫폼으로 구상하는 매트릭스 강성, ECM 단백질의 종류, 세포 리간드 밀도와 밀폐 된 접착에.
이 프로토콜의 목적은 쉽게 재료 과학에서 어떠한 지식없이 록시-PAAm 하이드로 겔을 제조하기위한 필요한 정보를 제공하는 것이다. 연구자 병태 생리 학적 기전에 관여 mechanotransduction의 경로를 더 잘 이해 될 수있는 세포 및 조직 수준에서 생리 관련 질문을위한 궁극적 목적은 수단을 제공하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현대 세포 생물학 체외 관측 많은 종종 ECM 단백질 또는 RGD 서열을 함유하는 합성 펩티드의 얇은 층으로 코팅 된 경질 유리 커버 슬립 상에 수행되었다. 그러나, 이러한 기본 배양 기질 세포 mechanotransduction의 프로세스 연구를위한 정확한 모델을 제공하지 않는, 따라서 ECM의 전체 물리 복잡도 요점을 되풀이하지 않는다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 원하는 금액과 ECM 단백질의 자?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
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