Automatische Trennung von<em> C. elegans</em> Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert
Summary
Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.
Abstract
Die wormsorter ist ein Instrument analog zu einem FACS-Maschine, die in den Studien von Caenorhabditis elegans verwendet wird, in der Regel, um Würmer, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporter sortieren. Hier stellen wir eine alternative Nutzung dieses Instruments für die Sortierung Würmer nach dem Grad der Kolonisierung durch einen GFP-exprimierenden Erregers. Diese neue Nutzung gestattet uns die Beziehung zwischen Kolonisierung des Darms Schnecke und Induktion von Immunreaktionen zu adressieren. Während C. elegans Immunreaktionen auf verschiedene Erreger dokumentiert worden ist, ist es noch nicht bekannt, was sie veranlasst. Die beiden wichtigsten Möglichkeiten (die nicht gegenseitig ausschließen) sind Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns, und den Nachweis von Schäden, die durch eine Infektion verursacht. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, muss die Exposition gegenüber dem Erreger aus der von ihm verursachten Schäden getrennt werden. Die wormsorter aktiviert Trennung von Würmern, die durch Gram-n extensiv besiedelt wurdenegative Erreger Pseudomonas aeruginosa, mit dem Schaden wahrscheinlich durch Erreger Last verursacht, von Würmern, die in ähnlicher Weise exponiert waren, aber nicht, oder geringfügig besiedelt. Diese unterschiedliche Populationen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Keimmenge und der Induktion von Immunantworten Transkriptions beurteilen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die beiden dissoziiert, unterstützt die Möglichkeit der Krankheitserreger Erkennung.
Introduction
Automatische Sortierschnecke ist ähnlich wie FACS, Betriebs durch Messen eines Fluoreszenzsignals in einer Schnecke (typischerweise durch transgene Expression von Reporterproteinen zur Verfügung gestellt), wie es geht in ein Rohr gerichtet, so dass die Umleitung entweder zu einem Sammelrohr / Vertiefung oder zu einem Abfallbehälter nach um Gating Parameter durch den Forscher 1 gesetzt. Die wormsorter kann die Forschung in vielerlei Hinsicht zu erleichtern, ein Beispiel der Verwendung es als analytisches Werkzeug ist eine Studie, die räumlich-zeitliche Muster der Promotoraktivität für fast 1.000 Gene 2 gefolgt.
Jedoch ist die Hauptanwendung des wormsorter in genetischen Screens, folgende Zielgenexpressionsniveaus oder Lokalisation des fluoreszierenden Proteins entlang der Achse der Schnecke 3-5.
Hier beschreiben wir eine neue Anwendung für die wormsorter, in folgenden Kolonisierung der Wurm von einem fluoreszenzmarkierten Erregers. Mit diesem als ein Werkzeug, das wir auf die Beziehung zwischen pathog fokussierten Kolonisation / Last und der Immunantwort, um neue Einblicke in die Mechanismen für die Initiierung von Immunreaktionen in der Wurm verantwortlich zu gewinnen.
In praktisch allen bisher untersuchten Organismen, Initiierung der angeborenen Immunantwort gegen mikrobielle Krankheitserreger, hängt von der Anerkennung pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und / oder Gefahr / Schaden-associated molecular patterns (gedämpft) 6,7. Die ersten konserviert sind mikrobielle Strukturen, Komponenten der mikrobiellen Zellwand, seine Flagellum oder dessen Lipid-Doppelschicht 6 umfassen, der zweite umfassen sowohl freigesetzten Moleküle (z. B. ATP 8), veränderte Proteine oder andere Marker von veränderten zellulären Prozessen 9,10. Beide Arten von Signalen sind als Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), die auf spezifische Bindung eines Moleküls aktivieren Muster eine Kette von Ereignissen, die eine schützende Antwort bezeichneten Proteinen erkannt. C elegans ist extrem nützlich als tracta gewesenble Modell, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu sezieren, aber eine Sache, die nicht gut verstanden wird, ist, wie Immunantworten werden in der Wurm gestartet. Keiner der vermeintlichen Rezeptoren, die orthologen zu pattern recognition receptors (PRR) in anderen Organismen haben gezeigt, dass PAMPs zu binden, und viele der Orthologen von PRRS, die entscheidend für Immunreaktionen in andere Organismen sind eine überraschend begrenzten Beitrag zur Schnecken Erreger Antworten und Widerstand. Zum Beispiel wird das Drosophila Toll-Rezeptor, die für Gram-positive Pathogene Widerstand ist, in C dargestellt elegans durch eine einzige Homolog, tol-1, die Schutz gegen gramnegative Erreger Salmonella Typhimurium 11 trägt, nicht aber von anderen getesteten Gram-negative oder-positive Erreger 11,12. Diese Beobachtungen, zusammen mit Daten, die anzeigen, dass Immunantworten konnte durch Unterbrechung zellulären Proteintranslation h induziert werdenso führte einige darauf hin, dass C. elegans erkennt vor allem dämpft 9,13,14. Dennoch deuten Berichte beschreiben Fähigkeit von toten Krankheitserreger, Immunantworten zu induzieren, dass PAMP Bindung kann eine wichtige Rolle in Krankheitserreger Anerkennung in C haben werden elegans 15,16. Frühere Arbeiten mit Schwerpunkt auf Immunantworten in alters synchronisiert genetisch identisch C. elegans Populationen zeigten große individuelle Unterschiede in der Darmbesiedlung durch die bakterielle Gram-negative Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa.
Allerdings Transkriptionsprofilierung Studien behandelt diese variabel kolonisierten Bevölkerung als eine Einheit 17,18. Unter Ausnutzung dieser Variabilität, wir ein Protokoll Fokussieren eines automatisierten wormsorter differentiell kolonisiert Populationen von Caenorhabditis elegans an GFP-exprimierenden S. ausgesetzt trennen entwickelten aeruginosa. Untersuchung der Genexpression in unterschiedlich kolonisierten Bevölkerung Facilitated Beurteilung der Beziehung zwischen Keimmenge (und der damit verbundenen Schädigung) und Immunreaktionen und lieferte neue Erkenntnisse über Pathogen Erkennung in C. elegans 19. Nachfolgend beschreiben wir das Protokoll, die angewendet könnten, um Würmer mit einem Fluoreszenz-markierten Erreger infiziert zu sortieren.
Potenziellen Anwendern ist anzumerken, dass die Anzahl der Würmer erforderlich aussortiert werden müssen, hängt von der Art der nachfolgenden Analysen und Protokolle benutzt werden. Zum Beispiel im Fall von Microarray-Genexpressionsanalyse,> 1.000 Würmer werden benötigt, um genügend RNA zu erhalten, wenn Standard-Protokolle verwendet werden, aber ~ 100 Würmer würde genügen, wenn Verstärkung eingesetzt wird, die eine schnelle Sammlung von Material und damit Minimierung von Stress zu die Würmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode, die wir beschreiben, nutzt Fluoreszenzmarkierung von Einrichtungen außerhalb der Schnecke, um Wechselwirkungen zwischen der Schnecke und ihrer Umgebung zu folgen. In dem Fall, wir präsentieren, wurde die Trennung über die Kennzeichnung von einem Krankheitserreger und wurde zu trennen Würmer mit schweren Krankheitserreger Last von diejenigen, die keine (oder Licht) Last eingesetzt. Nachfolgende Genexpressionsanalyse fanden keinen Unterschied in der Immunantworten zwischen den beiden Gruppen nahe legt, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Ellison Medical Foundation für ihre Unterstützung. Wir möchten auch die Mitglieder der Abby Dernburg Labor für die Unterstützung bei Verwendung des wormsorter danken.
Materials
| M9 Buffer | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| Rifampicin | Sigma | R3501 |
| Egg prep solution | Prepared in house | 50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide |
| NGM plates | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| SKP plates | Prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
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