La separación automatizada de<em> C. elegans</em> Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano
Summary
El wormsorter facilita pantallas genéticas en Caenorhabditis elegans clasificando gusanos de acuerdo a la expresión de los reporteros fluorescentes. Aquí se describe un nuevo uso: la clasificación de acuerdo a la colonización por un patógeno que expresa GFP, y lo empleamos para examinar el papel poco conocido de reconocimiento de patógenos en la iniciación de la respuesta inmune.
Abstract
El wormsorter es un instrumento similar a una máquina de FACS que se utiliza en los estudios de Caenorhabditis elegans, típicamente para ordenar gusanos basados en la expresión de un indicador fluorescente. Aquí, destacamos un uso alternativo de este instrumento, para la clasificación de los gusanos de acuerdo a su grado de colonización por parte de un agente patógeno que expresa GFP. Este nuevo uso nos permitió abordar la relación entre la colonización del intestino del gusano y la inducción de la respuesta inmune. Mientras C. las respuestas inmunes frente a diferentes patógenos elegans se han documentado, todavía no se sabe lo que los inicia. Las dos posibilidades principales (que no son mutuamente excluyentes) son el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, y la detección de los daños causados por la infección. Para diferenciar entre las dos posibilidades, la exposición al patógeno debe disociarse del daño que causa. El wormsorter permitido la separación de los gusanos que fueron colonizados extensamente por el Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, con el probable daño causado por la carga de patógenos, de los gusanos que fueron expuestos de manera similar, pero no es así, o marginalmente, colonizado. Se utilizaron estas poblaciones distintas para evaluar la relación entre la carga de patógenos y la inducción de respuestas inmunes de la transcripción. Los resultados sugieren que los dos se disocian, el apoyo a la posibilidad de reconocimiento de patógenos.
Introduction
Clasificación automática gusano es muy similar a FACS, operando mediante la medición de una señal fluorescente en un tornillo sin fin (normalmente proporcionado por la expresión transgénica de las proteínas informadoras) a medida que pasa enderezó en un tubo, lo que permite la redirección ya sea a un tubo de recogida / o bien a un contenedor de residuos de acuerdo para conmutar parámetros establecidos por el investigador 1. El wormsorter puede facilitar la investigación de muchas maneras, un ejemplo de emplearlo como herramienta de análisis es un estudio que siguió los patrones espacio-temporales de la actividad promotora de casi 1.000 genes 2.
Sin embargo, el uso principal de la wormsorter es en pantallas genéticos, siguiente objetivo los niveles de expresión de genes o localización de la proteína fluorescente a lo largo del eje del gusano 3-5.
Aquí se describe una nueva aplicación para el wormsorter, en el seguimiento de la colonización del gusano por un patógeno marcado con fluorescencia. Con esto como una herramienta que se centró en la relación entre Pathogen la colonización / carga y la respuesta inmune, para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos responsables de la iniciación de la respuesta inmune en el gusano.
En casi todos los organismos estudiados hasta la fecha, la iniciación de la respuesta inmune innata a patógenos microbianos depende del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), y / o peligro / daño-patrones moleculares asociados (amortigua) 6,7. Las estructuras microbianas primero se conservan que incluyen componentes de la pared celular microbiana, su flagelo, o su bicapa lipídica 6; el segundo, incluyen tanto moléculas liberadas (por ejemplo ATP 8), proteínas alteradas u otros marcadores de los procesos celulares alterados 9,10. Ambos tipos de señales son reconocidas por proteínas designadas como receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que tras la unión específica de una molécula patrón activar una cadena de eventos que conducen a una respuesta protectora. C. elegans ha sido extremadamente útil como tractamodelo ble para diseccionar los diversos aspectos de las interacciones huésped-patógeno, pero una cosa que no es bien entendido es cómo se inician la respuesta inmune en el gusano. Ninguno de los supuestos receptores que son ortólogos a los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) en otros organismos se ha demostrado que se unen PAMP, y muchos de los ortólogos de PRRS que son fundamentales para la respuesta inmune en otros organismos mostrar una contribución sorprendentemente limitado a las respuestas de patógenos gusano y la resistencia. Por ejemplo, el receptor Toll de Drosophila, que es esencial para resistir los patógenos Gram positivos, se representa en C. elegans por un único homólogo, Tol-1, lo que contribuye a la protección contra el patógeno Gram negativa Salmonella typhimurium 11, pero no de otros patógenos Gram-negativas, o-positivos 11,12 probados. Estas observaciones, junto con datos que indican que las respuestas inmunes podría ser inducido mediante la interrupción de la proteína celular traducción hcomo llevado a algunos a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPS 9,13,14. Sin embargo, informes que describen la capacidad de los patógenos muertos para inducir respuestas inmunes sugerir que PAMP de unión puede ser tiene un papel importante en el reconocimiento de patógenos en C. elegans 15,16. El trabajo previo se centra en la respuesta inmune en sincronizada edad genéticamente idénticos C. elegans poblaciones, demostraron una gran variabilidad individual en la colonización intestinal por el Gram-negative bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa.
Sin embargo, los estudios de perfiles transcripcionales tratan estas poblaciones colonizadas de forma variable-como una entidad 17,18. Tomando ventaja de esta variabilidad, se desarrolló un protocolo de enfocar una wormsorter automatizado para separar las poblaciones colonizadas de forma diferencial Caenorhabditis elegans expuestos a GFP-expresando P. aeruginosa. El examen de la expresión de genes en las poblaciones colonizadas de forma diferente-Facilitated evaluación de la relación entre la carga de patógenos (y el daño asociado) y las respuestas inmunes y proporcionado nuevas perspectivas sobre el reconocimiento de patógenos en C. elegans 19. A continuación se describe el protocolo, que podría ser aplicado para ordenar los gusanos infectados por el patógeno cualquier etiqueta fluorescente.
Para los usuarios potenciales cabe señalar que el número de gusanos requeridos para ser resuelto depende de la naturaleza de los análisis posteriores y protocolos en uso. Por ejemplo, en el caso de análisis de microarrays de expresión génica,> se requerirán 1000 gusanos para obtener suficiente ARN, si se utilizan protocolos estándar, pero ~ 100 gusanos sería suficiente si se emplea la amplificación, permitiendo colección rápido de material y minimizando así el estrés a los gusanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
The method we describe takes advantage of fluorescent labeling of entities outside of the worm, to follow interactions between the worm and its environment. In the case we present, separation was based on labeling of a pathogen and was employed to separate worms with heavy pathogen load from those with no (or light) load. Subsequent gene expression analysis found no difference in immune responses between the two groups suggesting that they were independent of pathogen load. The signal that initiates the response was show…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Ellison Medical Foundation for their support. We wish also to thank members of the Abby Dernburg laboratory for assistance with using the wormsorter.
Materials
| M9 Buffer | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| Rifampicin | Sigma | R3501 |
| Egg prep solution | Prepared in house | 50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide |
| NGM plates | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| SKP plates | Prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
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