A separação automática de<em> C. elegans</em> Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

Summary

O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.

Abstract

O wormsorter é um instrumento semelhante a uma máquina de FACS que é utilizado em estudos de Caenorhabditis elegans, tipicamente para classificar vermes baseados na expressão de um repórter fluorescente. Aqui, destacam-se um uso alternativo deste instrumento, para classificar os vermes de acordo com seu grau de colonização por um patógeno expressando GFP. Este novo uso nos permitiu resolver a relação entre a colonização do intestino sem-fim e a indução de respostas imunitárias. Enquanto C. elegans respostas imunes a diferentes patógenos têm sido documentados, ainda é desconhecido o que os inicia. As duas possibilidades principais (que não são mutuamente exclusivos) são o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, e detecção de danos causados ​​por infecção. Para diferenciar entre as duas possibilidades, a exposição ao patógeno deve ser dissociado do dano que ela causa. A separação wormsorter habilitado de vermes que foram amplamente colonizados pela Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, com a provável dano causado pela carga de patógenos, de vermes que foram igualmente expostos, mas não, ou marginalmente, colonizado. Estas populações distintas foram usadas para avaliar a relação entre a carga e o agente patogénico a indução de respostas imunitárias de transcrição. Os resultados sugerem que os dois são dissociados, apoiando a possibilidade de reconhecimento do patógeno.

Introduction

Classificação automática verme é muito parecido com FACS, operando através da medição um sinal fluorescente em um sem-fim (normalmente fornecida pela expressão transgênica de proteínas repórter) que passa ajeitou em um tubo, o que permite o redirecionamento ou a um tubo de coleta / bem ou para um recipiente de resíduos de acordo para modular parâmetros definidos pelo pesquisador ^1. O wormsorter pode facilitar a pesquisa de várias maneiras; um exemplo de empregá-la como instrumento de análise é um estudo que seguiu os padrões espaço-temporais de atividade do promotor para quase 1.000 genes ^2.
No entanto, o uso principal do wormsorter é nas telas genéticas, a seguir os níveis de expressão do gene alvo ou a localização da proteína fluorescente ao longo do eixo do sem-fim ^{de 3-5.}

Aqui, descrevemos uma nova aplicação para o wormsorter, seguindo a colonização do worm por um patógeno fluorescente etiquetado. Com isto como uma ferramenta que incidiu sobre a relação entre Pathogen colonização / carga e da resposta imune, para ganhar novos insights sobre os mecanismos responsáveis ​​pela iniciação das respostas imunes do worm.

Em praticamente todos os organismos estudados até o momento, o início da resposta imune inata a patógenos microbianos depende do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), e / ou padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece) ^6,7. As estruturas microbianas primeiro são conservadas que incluem componentes da parede celular microbiana, seu flagelo, ou sua bicamada lipídica ^6, o segundo, incluem ambas as moléculas libertadas (por exemplo ATP ^8), as proteínas modificadas ou outros marcadores de processos celulares alterados ^9,10. Ambos os tipos de sinais são reconhecidos pelas proteínas designadas como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), que, após a ligação específica de uma molécula padrão activam uma cadeia de eventos que conduzem a uma resposta protectora. C. elegans foi extremamente útil como um Tractamodelo ble dissecar vários aspectos da interação patógeno-hospedeiro, mas uma coisa que não é bem compreendido é a forma como as respostas imunes são iniciadas no worm. Nenhum dos receptores putativos que são ortólogos de receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) em outros organismos demonstraram ligar PAMPs, e muitos dos ortólogos de PRRs que são cruciais para as respostas imunes em outros organismos mostram surpreendentemente uma contribuição limitada para respostas verme patógeno e resistência. Por exemplo, o receptor Toll de Drosophila, que é essencial para resistir Gram positivos patogénicos, é representada em C. elegans por um único homólogo, tol-1, o que contribui para a protecção contra o agente patogénico Gram negativa Salmonella typhimurium ^11, mas não a partir de outros agentes patogénicos, ou-positivas gram-negativas testadas ^11,12. Estas observações, em conjunto com os dados que indicam que as respostas imunitárias poderia ser induzida por perturbar a tradução da proteína celular hcomo levou alguns a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPs ^9,13,14. No entanto, relatos que descrevem a capacidade de agentes patogénicos mortos para induzir respostas imunológicas sugerem que a ligação pode ser PAMP têm um papel importante no reconhecimento de patógenos em C. elegans ^15,16. Trabalhos anteriores com foco em respostas imunes em sincronizado idade geneticamente idênticos C. elegans populações, demonstraram grande variabilidade individual na colonização intestinal pela Gram-negativo patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa.

No entanto, estudos de perfis de transcrição tratada essas populações variavelmente-colonizados como uma entidade ^17,18. Aproveitando essa variabilidade, foi desenvolvido um protocolo visando ao wormsorter automatizado para separar populações colonizadas diferencialmente de Caenorhabditis elegans expostos a expressando GFP P. aeruginosa. Examinando a expressão genética em populações de forma diferente-colonizados FACIavaliação litated da relação entre a carga de patógenos (e os danos associados) e as respostas imunes e fornecidos novos insights sobre o reconhecimento do patógeno em C. elegans ^19. A seguir descreve-se o protocolo, o qual podia ser aplicado para classificar vermes infectadas com qualquer agente patogénico marcado por fluorescência.

Para potenciais utilizadores deve notar-se que o número de vermes necessários para ser resolvido depende da natureza das análises subsequentes e protocolos de uso. Por exemplo, no caso de análise de expressão do gene de microarray,> 1000 vermes será necessária para obter o ARN suficiente, se os protocolos padrão são usadas, mas aproximadamente 100 vermes seria suficiente, se é utilizada a amplificação, permitindo rápida recolha de material e, assim, minimizar o stress aos os vermes.

Protocol

1. A obtenção de uma Cultura Synchronized de Jovens Adultos Animais Crescer vermes em várias placas NGM semeados com OP50-1 E. bactérias coli (10x concentrada a partir de uma cultura saturada) até muitos vermes atingiram a fase gravídico. Trate os animais grávidas com solução ovo-prep para obter uma cultura sincronizado (ovos). Ovos placa em várias placas NGM 60 mm semeado com 10x concentrado OP50-1 a uma densidade de cerca de 150-200 ovos / placa. Inc…

Representative Results

Quando a idade-pareado, geneticamente idênticos C. elegans estão expostos a P. aeruginosa, uma ampla distribuição é observado em níveis de colonização (Figura 1A). Com a ajuda do protocolo descrito aqui a separação eficiente de não colonizados de vermes colonizados pode ser conseguida (Figura 1B). Ao contrário dos worms não colonizados, vermes colonizados mostrar sinais de danos, tais como lentidão e reduziu a defecação 19. Este último pode …

Discussion

O método que descrevemos aproveita de marcação fluorescente de entidades fora do worm, para acompanhar as interações entre o vírus e seu ambiente. No caso que apresentamos, a separação foi baseada em rotulagem de um patógeno e foi empregado para vermes separados com carga de patógenos pesado daqueles sem (ou luz) de carga. Análise de expressão gênica Subsequente não encontraram nenhuma diferença nas respostas imunes entre os dois grupos, sugerindo que eles foram independentes da carga de patógenos. O sin…

Materials

M9 Buffer	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	Prepared in house	50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide
NGM plates	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
SKP plates	Prepared in house	Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001