の自動分離<em> C.虫</em>可変細菌性病原体の植民地
Summary
wormsorterは蛍光レポーターの発現に応じてワームをソートすることによって線虫（Caenorhabditis elegans）における遺伝子スクリーニングを容易にします。 GFPを発現病原体によるコロニー形成に応じて仕分けし、我々は、免疫応答を開始における病原体認識のよくわかっていない役割を調べるためにそれを利用する：ここでは、新たな使用方法を説明します。
Abstract
wormsorterは蛍光レポーターの発現に基づいてワームを並べ替えることが一般的には、 線虫（Caenorhabditis elegans）の研究で使用されているFACS装置に類似した楽器です。ここでは、GFPを発現病原体によるコロニー形成の程度に応じてワームをソートするために、本器の代替使用状況を強調表示します。この新しい使用は、私たちは、ワームの腸や免疫応答の誘導の植民地との関係に対処することができました。一方、C.異なる病原体への虫の免疫応答は、それらを開始し何まだ不明ですが、文書化されている。 （相互に排他的ではない）2主な可能性が病原体関連分子パターンの認識、感染によって引き起こされた損傷の検出である。 2つの可能性を区別するために、病原体への暴露は、それが引き起こす損傷から解離されなければならない。グラムNによって広く保菌されたワームのwormsorter有効に分離植民同様に暴露されたワームの可能性が高い病原体の負荷による損傷はなく、またはわずかに、とegative病原緑膿菌 、。これらの異なる集団は、病原体負荷および転写免疫応答の誘導との間の関係を評価した。結果は、2つの病原体認識の可能性を支持し、解離していることを示唆している。
Introduction
自動ワームのソートは、それがチューブ内に真っ直ぐに通過すると（通常はレポータータンパク質のトランスジェニック発現によって提供される）ワームに蛍光シグナルを測定することにより、オペレーティング·リダイレクション、コレクションチューブに/ウェルまたは廃棄物容器に応じてできるように、多くのFACSのようなものです研究者1が設定したパラメータをゲーティングする。 wormsorterは、多くの方法で研究を容易にすることができる。分析ツールとして、それを採用した例はほとんど千の遺伝子2プロモーター活性の時空間パターンを踏襲研究である。
しかしながら、wormsorterの主な用途は、標的遺伝子発現レベル又はウォーム3-5の軸に沿った蛍光タンパク質の局在化に続いて、遺伝子スクリーニングである。
ここでは、蛍光タグ付けされた病原体によるワームの定着を、以下に、wormsorterための新しいアプリケーションを記述します。これによりツールとして、我々はpathogとの関係に焦点を当てた植民地化/負荷と免疫応答備わり、ワームでの免疫応答の開始に責任のメカニズムに新たな洞察を得るために。
これまでに研究され、事実上すべての生物では、微生物病原体に対する自然免疫応答の開始は、病原体関連分子パターン（PAMP）の認識に依存し、かつ/または危険/損傷関連分子パターン（減衰させる）6,7。微生物の細胞壁の構成成分、その鞭毛、またはその脂質二重層6、最初に保存されている微生物の構造は、第二には、両方の放出された分子（ 例えば 、ATP 8）、改変されたタンパク質または改変された細胞プロセス9,10の他のマーカーが含まれています。両方のタイプの信号は、パターン分子の特異的結合の際に防御応答を導く一連の事象を活性化するパターン認識受容体（PRR）として指定されたタンパク質によって認識される。C.虫は tractaとして非常に有用であったBLEモデルは、宿主 – 病原体相互作用のさまざまな側面を分析するが、十分に理解されていない一つのことは、ワームに開始されるか免疫応答である。他の生物におけるパターン認識受容体（PRR）にオーソロガスである推定される受容体のどれものPAMPに結合することが示されておらず、他の生物における免疫応答のために極めて重要であるのPRRのオルソログの多くは、ワームの病原体応答に驚くほど限られた貢献度を示していると抵抗。例えば、グラム陽性病原体に抵抗するために不可欠であるショウジョウバエのToll受容体は、C言語で表現されているグラム陰性病原体ネズミチフス菌11からではなく、他のテストのグラム陰性からの保護に貢献する唯一のホモログ、TOL-1による線虫 、または陽性病原体11,12。これらの観察は、その免疫応答を示すデータと組み合わせる細胞のタンパク質翻訳hを破壊することによって誘導することができLEDなどのいくつかが提案することで虫は、主に減衰9,13,14を検出します。それにもかかわらず、免疫応答を誘導するために死んだ病原体の能力を記述するレポートは、PAMPの結合は、C.における病原体認識に重要な役割を有し得ることを示唆する虫 15,16。年齢に同期化された遺伝的に同一のCの免疫応答に焦点を当てたこれまでの研究虫集団は、細菌のグラム陰性病原体緑膿菌による腸のコロニー形成に大きな個体差を示した。
しかし、転写プロファイリング研究は、1事業体17,18として、これらの可変保菌集団を処理した。この変動を利用して、我々は、GFPを発現するPにさらさ線虫（Caenorhabditis elegans）の差別的植民集団を分離するための自動化されたwormsorterを中心にプロトコルを開発緑膿菌 。異なっ – 植民集団における遺伝子発現をFACI調べる病原体の負荷（および関連する損傷）との関係の評価と免疫応答をlitated とCに病原体認識についての新たな洞察を提供虫 19。下に我々はすべての蛍光標識された病原体に感染したワームのソートに適用することができるプロトコルを記述します。
潜在的なユーザーには、選別されることが必要虫数は、使用中のその後の分析およびプロトコルの性質に依存することに留意すべきである。例えば、マイクロアレイ遺伝子発現解析の場合には、>千のワームは、標準的なプロトコルが使用される場合、十分なRNAを得るために必要とするが、増幅が用いられる場合約100ワームが十分である、材料の迅速な収集を可能にし、従って、ストレスを最小限にするワーム。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々が説明する方法は、ワームとその環境の間の相互作用に従うこと、ワームの外実体の蛍光標識を利用しています。我々はこの場合、分離は、病原体のラベリングに基づいていたなし（または光）負荷のものとは重い病原体負荷でワームを分離するために用いられた。その後の遺伝子発現分析は、それらが病原体負荷とは無関係であったことを示唆している二つのグループの間の免疫応答?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らのサポートのためにエリソン医療財団に感謝します。私たちは、wormsorterを使用しての支援のためのアビーデルンブルク研究室のメンバーに感謝したいとも。
Materials
| M9 Buffer | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| Rifampicin | Sigma | R3501 |
| Egg prep solution | Prepared in house | 50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide |
| NGM plates | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| SKP plates | Prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
- Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
- Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
- Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
- McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
- Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
- Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
- Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
- Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode’s innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
- Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).
