स्वचालित पृथक्करण<em> सी. एलिगेंस</em> अस्थायित्व से एक जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेश
Summary
wormsorter फ्लोरोसेंट पत्रकारों की अभिव्यक्ति के अनुसार कीड़े छँटाई द्वारा Caenorhabditis एलिगेंस में आनुवंशिक स्क्रीन की सुविधा. यहाँ, हम एक नए प्रयोग का वर्णन: एक GFP-व्यक्त रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेशन के अनुसार छँटाई, और हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने में रोगज़नक़ मान्यता के खराब समझ भूमिका की जांच करने के लिए यह रोजगार.
Abstract
wormsorter Caenorhabditis एलिगेंस की पढ़ाई में प्रयोग किया जाता है कि एक FACS मशीन के अनुरूप एक साधन है, जो आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के आधार पर कीड़े सॉर्ट करने के लिए. यहाँ, हम एक GFP-व्यक्त रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेशन के अपने डिग्री के अनुसार कीड़े छँटाई के लिए, इस उपकरण के लिए एक विकल्प के उपयोग पर प्रकाश डाला. इस नए प्रयोग हमें कीड़ा आंत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल के उपनिवेशवाद के बीच के रिश्ते को संबोधित करने की अनुमति दी. जबकि सी. विभिन्न रोगजनकों के लिए एलिगेंस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि यह उन्हें आरंभ करता है क्या अभी भी अज्ञात है, प्रलेखित किया गया है. (परस्पर अनन्य नहीं कर रहे हैं) दो मुख्य संभावनाओं रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न की पहचान, और संक्रमण की वजह से नुकसान का पता लगाने के हैं. दो संभावनाओं के बीच अंतर करने, रोगज़नक़ के लिए जोखिम का कारण बनता क्षति से अलग किया जाना चाहिए. ग्राम n द्वारा बड़े पैमाने पर-उपनिवेश थे कि कीड़े के wormsorter सक्षम जुदाईउपनिवेश इसी अवगत कराया गया कि कीड़े से होने की संभावना रोगज़नक़ लोड की वजह से नुकसान, लेकिन नहीं, या सीमांत, साथ egative रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa,. ये अलग आबादी रोगज़नक़ लोड और transcriptional प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शामिल के बीच संबंध का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. परिणाम दो रोगज़नक़ मान्यता की संभावना का समर्थन करते हुए अलग कर रहे हैं कि सुझाव देते हैं.
Introduction
स्वचालित कीड़ा छँटाई, यह एक ट्यूब में सीधा गुजरता है (आमतौर पर संवाददाता प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा प्रदान की) एक कीड़ा में एक फ्लोरोसेंट संकेत को मापने के द्वारा संचालन पुनर्निर्देशन या तो एक संग्रह ट्यूब को अच्छी तरह / या बर्बादी कंटेनर के अनुसार, की अनुमति ज्यादा FACS की तरह है शोधकर्ता 1 द्वारा निर्धारित मापदंडों gating के लिए. wormsorter कई मायनों में अनुसंधान की सुविधा कर सकते हैं, एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में यह रोजगार का एक उदाहरण लगभग 1,000 जीन 2 के लिए प्रमोटर गतिविधि के spatiotemporal पैटर्न का पालन किया है कि एक अध्ययन है.
हालांकि, wormsorter के प्रमुख उपयोग लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर या कीड़ा 3-5 की धुरी के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्थानीयकरण निम्नलिखित, आनुवंशिक स्क्रीन में है.
यहाँ, हम एक fluorescently टैग किया रोगज़नक़ द्वारा कीड़ा के उपनिवेशन निम्नलिखित में, wormsorter के लिए एक नया आवेदन का वर्णन. इस के साथ एक उपकरण के रूप में हम pathog के बीच के रिश्ते पर केंद्रितउपनिवेशन / भार और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एन, कृमि में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा के लिए जिम्मेदार तंत्र में नए अंतर्दृष्टि लाभ.
तारीख करने के लिए अध्ययन लगभग सभी जीवों में, माइक्रोबियल रोगज़नक़ों को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) की मान्यता पर निर्भर करता है, और / या खतरे / क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (damps) 6,7. माइक्रोबियल सेल दीवार, इसके कशाभिका, या अपने लिपिड bilayer 6 के घटक शामिल हैं कि पहले संरक्षित कर रहे हैं माइक्रोबियल संरचनाओं, दूसरा, दोनों जारी अणुओं (जैसे एटीपी 8), बदल प्रोटीन या बदल सेलुलर प्रक्रियाओं 9,10 के अन्य मार्करों शामिल हैं. संकेतों के दोनों प्रकार के विशिष्ट पर एक पैटर्न अणु के बंधन एक रक्षात्मक प्रतिक्रिया के लिए प्रमुख घटनाओं की एक श्रृंखला को सक्रिय जो पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs), के रूप में नामित प्रोटीन द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. सी. एलिगेंस एक tracta के रूप में अत्यंत उपयोगी हो गया हैble मॉडल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के विभिन्न पहलुओं को काटना, लेकिन अच्छी तरह से नहीं समझा गया है कि एक बात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कीड़ा में शुरू कर रहे हैं कि कैसे करने के लिए. अन्य जीवों में पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) को orthologous हैं कि ख्यात रिसेप्टर्स में से कोई भी PAMPs बाध्य करने के लिए दिखाया गया है, और अन्य जीवों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए निर्णायक हैं कि PRRs की orthologs के कई कीड़ा रोगज़नक़ उत्तर करने के लिए एक आश्चर्यजनक सीमित योगदान दिखाने और प्रतिरोध. उदाहरण के लिए, ग्राम पॉजिटिव रोगजनकों विरोध करने के लिए आवश्यक है जो ड्रोसोफिला टोल रिसेप्टर, सी. में प्रतिनिधित्व किया है यह दर्शाता डेटा के साथ संयुक्त नहीं बल्कि अन्य परीक्षण किया ग्राम नकारात्मक, या पॉजिटिव रोगजनकों 11,12 से, ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ साल्मोनेला 11 से संरक्षण के लिए योगदान देता है. इन टिप्पणियों एकमात्र Homolog, सहने-1,, द्वारा एलिगेंस कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सेलुलर प्रोटीन अनुवाद घंटे में बाधा पहुँचा द्वारा प्रेरित किया जा सकता हैके नेतृत्व के रूप में कुछ करने के लिए सुझाव है कि सी. एलिगेंस मुख्य रूप damps 9,13,14 का पता लगाता है. फिर भी, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए मृत रोगजनकों की क्षमता का वर्णन रिपोर्टों PAMP बंधन सी. में रोगज़नक़ मान्यता में एक महत्वपूर्ण भूमिका है हो सकता है एलिगेंस 15,16. उम्र सिंक्रनाइज़ आनुवंशिक रूप से समान सी. में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित पिछला काम एलिगेंस आबादी, जीवाणु ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa से आंतों उपनिवेशन में बड़ी व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया.
हालांकि, transcriptional रूपरेखा पढ़ाई एक इकाई 17,18 के रूप में इन अस्थायित्व-उपनिवेश आबादी का इलाज किया. इस परिवर्तनशीलता का लाभ उठाते हुए, हम GFP-व्यक्त पी. के संपर्क में Caenorhabditis एलिगेंस के विभिन्न उपनिवेश आबादी को अलग करने के लिए एक स्वचालित wormsorter ध्यान केंद्रित एक प्रोटोकॉल विकसित aeruginosa. अलग ढंग-उपनिवेश आबादी में जीन अभिव्यक्ति faci की जांचरोगज़नक़ लोड (और जुड़े नुकसान) और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सी में रोगज़नक़ मान्यता के बारे में उपलब्ध कराई गई नई अंतर्दृष्टि के बीच के रिश्ते की litated मूल्यांकन एलिगेंस 19. हम किसी भी fluorescently लेबल रोगज़नक़ से संक्रमित कीड़े सॉर्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है जो प्रोटोकॉल का वर्णन नीचे.
संभावित प्रयोक्ताओं के लिए इसे बाहर हल किया जाना आवश्यक कीड़े की संख्या में उपयोग में बाद के विश्लेषण और प्रोटोकॉल की प्रकृति पर निर्भर करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के मामले में,> 1,000 कीड़े मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है, तो पर्याप्त शाही सेना प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, लेकिन प्रवर्धन कार्यरत है अगर ~ 100 कीड़े पर्याप्त होगा, माल की तेजी से संग्रह की अनुमति है और इस तरह के लिए तनाव को कम करने कीड़े.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम वर्णन विधि कीड़ा और इसके माहौल के बीच बातचीत का पालन करने के लिए, कृमि के बाहर संस्थाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग का लाभ लेता है. हम वर्तमान मामले में, जुदाई एक रोगज़नक़ की लेबलिंग के आधार पर किया गया था औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने समर्थन के लिए एलिसन मेडिकल फाउंडेशन धन्यवाद. हम wormsorter उपयोग करने के साथ सहायता के लिए एबी Dernburg प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद भी कामना करते हैं.
Materials
| M9 Buffer | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| Rifampicin | Sigma | R3501 |
| Egg prep solution | Prepared in house | 50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide |
| NGM plates | Prepared in house | Recipe at wormbook.org |
| SKP plates | Prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
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