Automatisert Separering av<em> C. elegans</em> Trinnløs kolonisert av en bakteriell Patogen

Summary

Den wormsorter letter genetiske skjermer i Caenorhabditis elegans ved å sortere ormer ifølge uttrykk for fluorescerende reportere. Her beskriver vi en ny bruk: sortering i henhold til kolonisering av en GFP-uttrykke patogen, og vi bruker den til å undersøke dårlig forstått rolle patogen anerkjennelse i å initiere immunresponser.

Abstract

Den wormsorter er et instrument som er analog med FACS en maskin som blir brukt i studier av Caenorhabditis elegans, typisk for å sortere ormer basert på ekspresjon av en fluorescerende reporter. Her markerer vi en alternativ bruk av dette instrumentet, for sortering ormer i henhold til deres grad av kolonisering av en GFP-uttrykke patogen. Denne nye bruken tillot oss å ta opp forholdet mellom kolonisering av ormen tarmen og induksjon av immunresponser. Mens C. elegans immunresponser mot forskjellige patogener har blitt dokumentert, det er fortsatt ukjent hva som initierer dem. De to viktigste muligheter (som ikke er gjensidig utelukkende) er anerkjennelse av patogen-assosiert molekylære mønstre, og påvisning av skade forårsaket av infeksjon. For å skille mellom de to mulighetene, må eksponeringen mot patogen være skilt fra skaden den forårsaker. Den wormsorter aktivert separasjon av ormer som ble utstrakt-kolonisert av Gram-negative patogene Pseudomonas aeruginosa, med skaden sannsynligvis forårsaket av patogen belastning, fra ormer som ble eksponert på samme måte, men ikke, eller marginalt, kolonisert. Disse distinkte populasjoner ble brukt for å bedømme forholdet mellom patogenet belastning og induksjon av transkripsjonelle immunresponser. Resultatene tyder på at de to er skilt, støtter muligheten for patogen anerkjennelse.

Introduction

Automatisk sortering orm er mye som FACS, som opererer ved å måle et fluorescerende signal på en snekke (typisk ved hjelp av transgen ekspresjon av rapportør proteiner) når den passerer utbrettet i et rør, slik at omdirigering enten til en oppsamlingsrøret / brønn eller til en avfallsbeholder ifølge å gating parametre satt av forskeren ^en. Den wormsorter kan rette for forskning på mange måter, et eksempel for å ansette den som et analytisk verktøy er en studie som fulgte Spatiotemporal mønstre av promoter aktivitet for nesten 1000 gener ^to.
Imidlertid er den viktigste bruk av wormsorter i genetiske skjermer, som følge målet genekspresjon nivåer eller lokalisering av fluorescerende protein langs aksen av spiralen ^3-5.

Her beskriver vi en ny søknad om wormsorter, i følge kolonisering av ormen av en fluorescently merket patogen. Med dette som et verktøy vi fokusert på forholdet mellom patogeneno kolonisering / belastning og immunrespons, for å få ny innsikt i mekanismene som er ansvarlig for initiering av immunresponser i ormen.

I nesten alle organismer studert til dags dato, initiering av medfødte immunresponser mot mikrobielle patogener avhenger anerkjennelse av patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs), og / eller fare / skade-forbundet molekylære mønstre (demper) ^6,7. Den første er bevart mikrobielle strukturer som inkluderer komponenter av den mikrobielle celleveggen, sin flagellen, eller dens lipidbilag ^6, den andre, inkluderer både utgitt molekyler (f.eks ATP ^8), endrede proteiner eller andre markører av endrede cellulære prosesser ^9,10. Begge typer av signaler blir gjenkjent av proteiner som er utpekt til mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs), som ved spesifikk binding av et mønster molekyl aktiverer en kjede av hendelser som fører til en beskyttende respons. C. elegans har vært svært nyttig som en tractalig modell for å dissekere ulike aspekter av host-patogen interaksjoner, men en ting som ikke er godt forstått er hvordan immunresponser er initiert i ormen. Ingen av de putative reseptorer som er ortologe til mønstergjenkjennings reseptorer (PRRs) i andre organismer er blitt vist å binde PAMPs, og mange av de orthologs av PRRs som er avgjørende for immunresponser i andre organismer viser en overraskende begrenset bidrag til snekke patogene responser og motstand. For eksempel er Drosophila Toll-reseptoren, noe som er viktig for å motstå Gram-positive patogener, representert i C. elegans av en eneste homolog, tol-en, noe som bidrar til beskyttelse mot Gram negative patogen Salmonella Typhimurium ^11, men ikke fra andre testede Gram-negative, eller-positive patogener ^11,12. Disse observasjonene, kombinert med data som indikerer at immunresponser kan bli indusert ved å forstyrre celleprotein oversettelses hsom ledet noen til å foreslå at C. elegans primært oppdager DAMPS ^9,13,14. Likevel, rapporter som beskriver evne til døde patogener å indusere immunresponser tyder på at PAMP binding kan ha en viktig rolle i patogen anerkjennelse i C. elegans ^15,16. Tidligere arbeid med fokus på immunresponser i alders synkronisert genetisk identiske C. elegans populasjoner, viste stor individuell variasjon i intestinal kolonisering av bakteriell Gram-negative patogen Pseudomonas aeruginosa.

Men transcriptional profilering studier behandlet disse variabelt-koloniserte befolkninger som en enhet ^17,18. Benytte seg av denne variasjonen, utviklet vi en protokoll som fokuserer en automatisert wormsorter å skille differentially kolonis bestander av Caenorhabditis elegans utsatt for GFP-uttrykke P. aeruginosa. Undersøke genuttrykk i annerledes-koloniserte befolkninger Facilitated vurdering av forholdet mellom patogen belastning (og tilhørende skader) og immunresponser og gitt ny innsikt om patogen anerkjennelse i C. elegans ^19. Nedenfor beskriver vi protokollen, som kan brukes til å sortere ormer smittet med noe fluorescensmerkede patogen.

Til potensielle brukere det bør bemerkes at antall ormer som kreves for å bli sortert ut, avhenger av arten av de etterfølgende analyser og protokoller i bruk. For eksempel, i det tilfelle mikromatrise genekspresjonsanalyse av,> 1000 ormer vil være nødvendig for å oppnå tilstrekkelig RNA, hvis standard protokoller benyttes, men ~ 100 ormer vil være tilstrekkelig hvis forsterkning er ansatt, slik at hurtig samling av materiale og dermed minimalisere stress ormer.

Protocol

En. Innhenting av en synkronisert Kultur Unge voksne dyr Grow ormer på flere NGM plater seeded med OP50-en E. coli-bakterier (10x konsentrert fra en mettet kultur) før mange ormer har nådd gravid stadium. Unn av gravid dyr med egg-prep løsning for å få et synkronisert kultur (egg). Plate egg på flere 60-mm NGM plater podet med 10x konsentrert OP50-1 med en tetthet på omtrent 150 til 200 egg / plate. Inkuber platene ved 25 ° C i 2 dager (inntil ormer har nådd L4…

Representative Results

Når alders matchet, genetisk identiske C. elegans er utsatt for P. aeruginosa, er en bred fordeling observert i nivåer av koloniseringen (figur 1A). Med hjelp av den protokoll som er beskrevet her for effektiv separasjon av noncolonized fra kolonis ormer kan oppnås (figur 1B). I motsetning noncolonized ormer, kolonis ormer viser tegn på skade, slik som treghet og redusert avføring 19. Sistnevnte kan være en grunn til at ormer kolonisert av P. aerug…

Discussion

Metoden vi beskrive utnytter fluorescerende merking av enheter utenfor ormen, for å følge samspillet mellom ormen og dens omgivelser. I tilfelle vi presenterer, ble separasjon basert på merking av et patogen og ble ansatt til separate ormer med tung patogen last fra de med ingen (eller lys) belastning. Etterfølgende genekspresjonsanalyser fant ingen forskjell i immunresponser mellom de to gruppene som tyder på at de var uavhengige av patogen belastning. Det signal som initierer reaksjonen ble vist andre steder for …

Materials

M9 Buffer	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	Prepared in house	50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide
NGM plates	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
SKP plates	Prepared in house	Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001