PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.
דג הזברה היא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח, דוגמנות מחלה, וביצוע הקרנת סמים. לאחרונה מגוון רחב של כלים גנטיים הוכנסו, כולל אסטרטגיות רבות לגרימת מוטציות ויצירת קווים מהונדסים. עם זאת, הקרנה בקנה מידה גדולה היא מוגבלת על ידי שיטות גנוטיפ מסורתיות, אשר גוזל זמן ועבודה אינטנסיבית. כאן אנו מתארים טכניקה לנתח גנוטיפים דג הזברה על ידי PCR בשילוב עם ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA). גישה זו היא מהירה, רגישה, ולא יקרה, עם סיכון נמוך יותר של חפצי זיהום. Genotyping ידי PCR עם HRMA יכולה לשמש לעוברים או דגים בוגרים, לרבות בפרוטוקולי הקרנת תפוקה גבוהה.
דג הזברה (Danio rerio) היא מערכת מודל חוליות בשימוש נרחבת למחקרים של פיתוח ומודלים מחלה. לאחרונה, טכנולוגיות מהונדסים ומוטציה רבות פותחו עבור דג הזברה. טכניקות transgenesis מהירה, בדרך כלל מבוססות על מערכת transposon Tol2 1, כבר בשילוב עם אפשרויות שיבוט משופרות להרכבת קטע DNA מספר 2. nucleases אבץ האצבע (ZFNs) וnucleases השעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) שימשו למקד לוקוסים בשני תאים סומטיים וgermline ב3,4 דג הזברה. טכניקות אלו יעילות יכולות ליצור בעלי חיים מהונדסים גנטי, עם יצירת מוטציה בתדירות גבוהה וניבט קו תמסורת 3,4.
למרות ההתפתחויות הללו, טכניקות גנוטיפ מסורתיות בדג הזברה להגביל את העצמה המלאה של הכלים mutagenesis וtransgenesis. PCR ואחריו ג'ל אלקטרופורזה, לעתים בשילוב עם restrictioעיכול אנזים n, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות שינוי הגנום, אבל הוא גוזל זמן ופחות רגיש לזהות הוספות קטנות או מחיקות. יש מבחני הבדיקה TaqMan עלויות ראשוניות גבוהות ודורשים אופטימיזציה זהירה. רצף של מוצרי ה-PCR יכול לקחת כמה ימים ולא מעשי להקרנה בקנה מידה גדולה. ניתוח פולימורפיזם בר הגבלת אורך (RFLP) יכול רק להפלות SNPs המשפיע על מגוון מצומצם של אתרי הכרת אנזים הגבלה.
ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRMA), שיטת ניתוח סגור צינור שלאחר PCR, היא שיטה שפותחה לאחרונה, כי הוא מהיר, רגיש, זול, ונוח להקרנת מספר גדול של דגימות. HRMA יכול לשמש כדי לזהות SNPs, מוטציות, וtransgenes 5-7. HRMA מבוסס על denaturation תרמית של DNAs פעמיים תקועים, ויש לו כל amplicon PCR דיסוציאציה ייחודית (להמס) אופיינית 5. יכולה להיות מופלים לדגימות לא בשלo ההרכב שלהם שונה נוקלאוטיד, תוכן GC, או האורך, בדרך כלל בשילוב עם צבע פלואורסצנטי שרק נקשר גדילי הדנ"א כפול 8. לפיכך, HRMA יכול להבחין גנוטיפים שונים בהתבסס על המאפיינים להמיס עקומה השונות. בגלל HRMA משתמש ריאגנטים עלות נמוכה והוא תהליך שלאחר PCR בשלב יחיד, ניתן להשתמש בו לאסטרטגיות תפוקה גבוהה. HRMA הוא הורסות, כך שלאחר ניתוח amplicons PCR יכולה לשמש ליישומים אחרים. HRMA הוחל באורגניזמים רבים ומערכות, כוללים שורות תאים, עכברים ובני אדם 9-11. לאחרונה השימוש בו כבר תאר בדג זברה כדי לזהות מוטציות הנגרמות על ידי nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וTALENs 6,12,13.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע HRMA PCR מבוסס בדג זברה עוברית ובוגרת (איור 1). פרוטוקול זה מתאים לאיתור SNPs, transgenes, ומוטציות, ובכלל זה siשינויי ngle בסיס זוג, הוספות או השמטות.
PCR בשילוב עם HRMA הוא טכנולוגיה רבת עוצמה לגנוטיפ דג הזברה. היתרונות של גישה זו הם המהירות שלו, חוסן, ורגישות לזיהוי מוטציות אפילו נקודה. כל הפרוטוקול, מניתוח כדי להמס עקומת סנפיר קליפ, יכול להתבצע תוך פחות משמונה שעות על ידי אדם אחד. בנוסף, הטכניקה היא נוחה להקרנת תפוקה ג…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברים של מעבדות Blaschke, גרינוולד, וWittwer לקבלת ייעוץ וסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי קרן PCMC, NIH R01 MH092256 וDP2 MH100008, והמצעד הפרוטות קרן # מענק מחקר 1-FY13-425, לJLB.
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
Tricaine | ||||
Paraformaldehyde |