Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа
Summary
ПЦР в сочетании с анализом расплава с высоким разрешением (HRMA) демонстрируется в качестве быстрого и эффективного метода для генотипа данио.
Abstract
Данио рерио является мощным позвоночных модельной системой для изучения развития, моделирования заболевания, а также выполнение скрининга препарата. Недавно целый ряд генетических инструментов были введены, в том числе несколько стратегий вызывая мутации и получения трансгенных линий. Однако масштабное обследование ограничивается традиционными методами генотипирования, которые много времени и трудоемким. Здесь мы опишем технику для анализа данио генотипов от ПЦР в сочетании с анализом высокого разрешения плавления (HRMA). Этот подход является быстрым, чувствительным и недорогой, с более низким риском артефактов загрязнения. Генотипирование с помощью ПЦР с HRMA могут быть использованы для эмбрионов или взрослых рыб, в том числе в скрининговых протоколах высокой пропускной.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) является позвоночным модель системы широко используются для изучения разработки и моделирования заболевания. В последнее время многие трансгенные и мутации технологии были разработаны для данио. Быстрые методы трансгенеза, как правило, на основе системы транспозонов Tol2 1, были объединены с улучшенными опциями клонирования для многократного монтажа фрагментов ДНК 2. Цинк-пальцевые нуклеазы (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) были использованы для локусы в обоих соматических и половых клетках в данио 3,4. Эти методы могут эффективно генерировать генетически модифицированных животных, с созданием мутаций высокочастотной и передачи зародышевой линии 3,4.
Несмотря на эти успехи, традиционные методы генотипирования на рыбках данио ограничить всю мощь мутагенеза и трансгенеза инструментов. ПЦР с последующей гель-электрофореза, иногда в сочетании с ОГРАНИЧЕНИЯн фермент пищеварение, широко используется для обнаружения изменения генома, но требует много времени и менее чувствительны, чтобы определить небольшие вставки или делеции. TaqMan зондов анализы имеют высокие первоначальные затраты и требуют тщательной оптимизации. Секвенирование продуктов ПЦР может занять несколько дней и не практично для крупномасштабной проверки. Анализ длина Ограничение фрагмент полиморфизм (ПДРФ) может только различать ОНП, влияющие ограниченный диапазон сайтов рестрикции фермента распознавания.
Анализ высокого разрешения плавления (HRMA), метод анализа пост-ПЦР закрытого трубка, является недавно разработанный метод, который является быстрым, чувствительным, недорогой и поддаются скрининга большого количества образцов. HRMA может быть использован для обнаружения полиморфизмов, мутации и трансгены 5-7. HRMA основана на тепловой денатурации двухцепочечных ДНК, и каждый ПЦР ампликона имеет уникальный диссоциации (расплава) характерный 5. Образцы могут подвергаться дискриминации из-за то их различный состав нуклеотидов, содержание GC, или длина, как правило, в сочетании с флуоресцентным красителем, который связывается только двухцепочечной ДНК 8. Таким образом, HRMA можно выделить различные генотипы на основе различных характеристик расплава кривой. Поскольку HRMA использует недорогие реагенты и состоит из одного этапа после ПЦР, она может быть использована для стратегий высокой пропускной. HRMA является неразрушающим, так что следующее анализа ампликонов ПЦР могут быть использованы для других приложений. HRMA была применена во многих организмов и систем, в том числе клеточных линий, мышей и человека 9-11. Его использование в последнее время были описаны у рыбок данио для обнаружения мутаций, вызванных цинкового пальца нуклеаз (ZFNs) и Talens 6,12,13.
В этой статье мы расскажем, как выполнять на основе ПЦР HRMA в эмбриональном и взрослых данио (рис. 1). Этот протокол подходит для обнаружения ОНП, трансгены, и мутации, в том числе сиngle изменения базового пара, вставки или удаления.
Protocol
Representative Results
Discussion
ПЦР в сочетании с HRMA это мощная технология для рыбок данио генотипирования. Преимущества этого подхода заключаются в его скорость работы, надежность и чувствительность для обнаружения даже точечные мутации. Весь протокол, с трубчато-клипа анализа расплава кривой, может быть выполнена…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Бляшке, Grunwald, и Wittwer лаборатории для консультаций и технической помощи. Эта работа проводится при поддержке PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 и DP2 MH100008, и марте Dimes Foundation исследовательский грант № 1-FY13-425, к JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
